发酵产物的分离纯化.doc

第五章 发酵产物的分离纯化下游加工亦称发酵后处理，是指从发酵液或酶反应中分离纯化目的产物并加工成成品的过程。第一节 下游加工过程概述一、下游加工过程的重要性：1. 获得商业产品的关键环节。2. 拥有市场竞争力的重要保证。二、下游加工过程的特点1. 发酵液是复杂的多相系统，属非牛顿液体，从中分离所需产品困难大。2. 发酵产品在培养液中具有浓度低，稳定性差，对酸碱等外界环境十分敏感，容易失活。3. 下游加工过程代价昂贵，产品回收率不是很高。4. 发酵过程复杂，要求下游加工工艺应具有相当的适应性，以确保最终产品的纯度和质量。三、下游加工工程的一般流程1.发酵液的预处理和固-液分离。2.产物的初分离3.产物的高度纯化4.成品加工 第二节 发酵液的预处理与固-液分离一、发酵液的一般特征 1. 含水量高2. 产品浓度3. 悬浮物颗粒小，密度与液体相差不大 4. 固体粒子可压缩性大 5. 液体黏度大，大多为非牛顿型流体 6. 产物性质不稳定二、发酵液预处理的目的和要求1.预处理的目的 （1）改变发酵液的物理性质，促进悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离器的效率 （2）尽可能使产物转入便于后处理的某一相中（多数是液体） （3）去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步操作。2.发酵液预处理的要求: （1）菌体的分离 （2）固体悬浮物的去除 （3）蛋白质的去除 （4）重金属离子的去除 （5）色素、热原质、毒性物质等有机杂质的去除 （6）改变发酵液的性质 （7）调节适宜pH值和温度三、发酵液预处理的方法：1. 重力法2. 热处理法3.等电点法4. 絮凝法1. 重力法在工业上用的较多的主要是离心和过滤。过滤常用板框真空吸滤或电动筛等，离心和过滤能否顺利进行取决于很多因素。一般温度高，压力大，发酵液粘度小，滤布选用适当，助溶剂适宜，搅拌都可以提高过滤速度。2、加热法降低悬浮液的黏度，除去某些杂蛋白，降低悬浮物的最终体积，破坏凝胶状结构、增加滤饼的空隙度。不适用热敏性的物质3、等电点法调节溶液pH至等电点处，可使两性电解质所带净电荷为零，相邻分子之间由于没有静电斥力而趋于沉淀。适用于氨基酸、蛋白质和其他两性物质的沉淀分离。4. 凝聚和絮凝法原理：电解质将胶体粒子表面上的电荷中和，减少存在于胶体粒子间的静电斥力，使范德华力占优势，这样胶体就会凝聚成较大、较密实的粒子（凝聚）。或在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团使之更容易过滤（絮凝）。常用的凝聚方法：在稀溶液中加入电解质以促进凝聚。试剂包括酸、碱、简单电解质和合成的高分子电解质。常用的絮凝剂：明胶、甲基纤维素、多聚丙烯酸、聚胺衍生物、氯化钙、磷酸氢二钠影响絮凝的因素：絮凝剂的添加量、发酵液的pH、絮凝剂的分子量、搅拌转速、搅拌时间四、发酵液的相对纯化1. 高价无机离子的去除 去除钙离子：通常使用草酸。但由于草酸溶解度较小，不适合用量较大的场合，可用其可溶性盐，草酸价格昂贵，注意回收。去除镁离子：加入三聚磷酸钠，与镁离子形成络合物。用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。去除铁离子：可加入黄血盐，使其形成普鲁士蓝沉淀而除去。 2. 杂蛋白质的除去（1）沉淀法 蛋白质在酸性溶液中，能与一些阴离子，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀； 蛋白质在碱性溶液中，能与一些阳离子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和Pb2+等形成沉淀。（2）吸附法 加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。 （3）变性法 蛋白质由有规则的排列到无规则结构的变化过程成为变性。变性的蛋白溶解性小。使蛋白质变性的方法有：加热，调节pH，加酒精等有机溶剂或表面活性剂等 。变性法的局限性：加热法只适合于对热较稳定的目的产物；极端pH也会导致某些目的产物失活，并且要消耗大量酸碱；而有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。五、固-液分离过程及设备简介意义：固-液分离过程下游加工的重要环节，用于发酵液的预处理和生物产品的纯化、精制等环节。方法：常用的方法有过滤、离心。此外还有膜分离、双水相萃取和扩张床吸附等方法。影响发酵液固-液分离的主要因素：菌体的大小、形状及发酵液的黏度，还有发酵液的温度、pH值、加热时间等。1. 过滤：用过滤介质将悬液中的固形颗粒与液体分离的过程。常用的过滤方式：加压过滤和真空过滤典型设备主要有：板框压滤机和鼓式真空过滤机（1）板框压滤机 1）优点：板框压滤机的过滤面积大；过滤推动力(压力差)能较大幅度地进行调整，并能耐受较高的压力差；结构简单，价格低；动力消耗少等优点。 2）缺点：不能连续操作，设备笨重，劳动强度大；卫生条件差；非生产的辅助时间长，阻碍了过滤效率的提高。 （2） 鼓式真空过滤机 1）优点：能连续操作，能实现自动化控制 2）缺点：压差较小，主要适用于霉菌发酵液的过滤。 2. 离心分离 ：让液料再离心力场作用下促使其固形颗粒加速沉降已液体分子分离的过程。离心机按转速有常速、高速、超速三种。工业生产中常用的离心设备主要有：管式和碟式离心机。另一种常用的离心设备是倾析式（或称螺旋式卸料）离心机。（1）优点：分离速度快，效率高， 操作时卫生条件好等优点， 适合于大规模的分离过程。 （2）缺点： 投资费用高， 能耗较大。 3. 其他固-液分离方法（1）膜分离：利用不同组分通过膜的传递速度不同而得以分离的方法（2）双水相萃取：利用不同组分在双水相分配系数不同进行分离方法。（3）扩张床吸附：将固-液分离合目的产物吸附合并成一步进行的一种分离方法。六、微生物细胞的破碎2. 常用的细胞破碎方法根据外加作用力的方式可分为机械法和非机械法两大类。可按所用方法的属性分为物理法、化学法和生物法三类。物理破碎法：高压匀浆法、挤压法、高速珠磨法、超声波法；化学破碎法：渗透冲击法、增溶法。生物破碎法：酶溶法（1）物理破碎法高压匀浆法 大规模细胞破碎的常用方法原理：利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎。适用范围：适用于酵母菌、大肠杆菌、巨大芽孢杆菌和黑曲霉等。不适用于高度分枝的微生物。特点：在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。挤压法（X-press法）将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25至-30形成冰晶体，利用500 MPa以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出使之破碎。原理：细胞破碎是由于冰晶体在受压时的相变，包埋在冰中的细胞变形所引起的。主要用于实验室中。优点：适用的范围广、破碎率高、细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高。缺点：对冷冻-融解敏感的生化物质不适用。高速珠磨法原理：进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。优点：可连续操作缺点：破碎中产生的热量，需采用冷却措施。超声波破碎法超声波破碎也是应用较多的一种破碎方法。通常采用的超声波破碎机在15-25千赫（kHz）的频率下操作。原理：在超声波作用下液体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。缺点：容易引起温度的剧烈上升，操作需要冷却。超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。特点：杆菌比球菌易破碎，革兰氏阴性菌细胞比革兰氏阳性菌易破碎，酵母茵效果较差。菌体浓度太高或介质黏度高，均不利于超声波破碎。应用范围：产生的热量不容易驱散在实验室和小规模生产中是一种很好的方法。（2）化学破碎法：利用化学试剂改变细胞壁或膜的的结构或完全破除细胞壁形成原生质体后，在渗透压作用下使从而使细胞膜破裂而释放胞内物质的方法。优点：对产物的释出选择性好，细胞外形较完整、碎片少、核酸等胞内杂质释放少，便于后步分离等优点，故使用较多。缺点：容易引起活性物质失活破坏；化学试剂的加入，常会给随后产物的纯化带来困难，并影响最终产物纯度。特点：较温和的一种破碎方法，操作也简单。应用：仅对细胞壁较脆弱的菌，或者细胞壁预先用酶处理，或合成受抑制而强度减弱时才是合适的。渗透压冲击原理：将细胞放在高渗透压的介质中，达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。原理：利用某些化学试剂如有表面活性剂等，增加细胞壁或膜的通透性，而使细胞破碎的方法。增溶法:该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。 （3）生物破碎法常用的生物破碎法主要是酶溶法。利用生物酶分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破壁的目的。 利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序。酶溶法的优点：选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。缺点：溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶），产物抑制的存在。（2）外加酶法（2）自溶作用：是一种特殊的酶溶方法，所需溶胞的酶是由微生物本身产生的，而不需要外加其它的酶。影响自溶过程的因素有温度、时间、pH缓冲液浓度、细胞代谢途径等。应用：在一定程度上能用于工业规模，但是，对不稳定的微生物容易引起所需蛋白质的变性，自溶后的细胞培养液过滤速度也会降低。2. 破碎率的测定 测定细胞破碎率的常用方法：直接计数法测定释放的蛋白质含量或酶活量测定导电率第三节 发酵产物的初分离一、沉淀法定义：通过改变条件或加入某种试剂，使发酵产物离开溶液，生成不溶性颗粒而沉降析出的过程。作用：浓缩作用大于纯化作用，是初步分离的一种手段。优点：沉淀法具有设备简单、成本低、原料易得、收率高、浓缩倍数高和操作简单等优点。缺点：于过滤困难、产品质量较低、需要重新精制。1. 盐析原理：高浓度中性盐存在下，使生物分子在水溶液中溶解的溶解度降低而产生沉淀的方法，多用于蛋白质（酶）的分离。常用的盐类是硫酸铵。优点： 成本低，不需要特别昂贵的设备。 操作简单、安全。 对许多生物活性物质具有稳定作用。（1）盐析机制盐溶：盐低时，S（蛋白质的溶解度）随盐增加而增加；盐析：盐高时，S（蛋白质的溶解度）随盐增加而降低；（2）溶解度与盐浓度的关系可用下式表示： logS=KSI S：蛋白质的溶解度； I：离子强度； ：常数，与蛋白质种类有关，与盐的种类无关； KS ：盐析常数，与盐种类有关，与温度和pH无关；盐的种类：影响KS，KS越大，效果越好 溶质的起始浓度 盐析剂用量温度和pH：影响值而影响S。尤其是影响相对溶解度杂质（3）影响盐析的因素2. 等电点沉淀原理：利用两性电解质在在低离子强度下，调节至等电点，可使各种两性电解质所带净电荷为零，能大大降低其溶解度，形成沉淀。不同的两性电解质具有不同的等电点，从而将其分离开。优点：操作简单，试剂消耗少，引入杂质少。缺点：不能完全沉淀析出，常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。应用：主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。等电点操作时要注意： 溶液中离子的种类和浓度对生物分子等电点的影响。 等电点附近的盐溶作用 目的产物的不稳定性。等电点锌盐法 3. 有机溶剂沉淀定义：于水互溶的有机溶剂（乙醇、丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。多用于生物小分子、多糖、核酸和蛋白质等产品的提取。机理：降低溶液的介电常数，因为分子间的静电引力和溶剂的介电常数成反比，加入有机溶剂，蛋白质分子间的引力增加，溶解度降低。常用有机溶剂：乙醇、甲醇、丙酮等。缺点：容易引起蛋白质变性失活，并且有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。 优点：分辨能力比盐析法高，一种溶质只在一个比较窄的有机溶剂范围内沉淀；沉淀不需脱盐；有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，容易进行固液分离；有机溶剂容易蒸发，不会在成品中残留，适用于食品、药品的制备。4. 非离子型多聚物沉淀定义：水溶性的非离子多聚物如聚乙二醇（PEG）、葡聚糖右旋糖酐硫酸钠等，可用于沉淀分离蛋白质（尤其是不稳定的蛋白质）、DNA和RNA等。机制：多聚物与有机溶剂相似，能降低水化度使蛋白质沉淀；与大分子形成复合物，发生共沉淀作用等应用最多的是PEG。优点：其操作条件温和，不易引起生物大分子的变性，沉淀效能高，很少量的沉淀剂就可以使相当多的生物大分子沉淀，且沉淀后的多聚物也容易除去，无毒、不可燃，对大多数蛋白质有保护作用。应用：广泛用于蛋白质、核酸、细菌和病毒等的分离纯化。 二、萃取法定义：利用不同物质在选定溶剂中具有不同的溶解度的原理来进行不同物质的分离纯化。优点：选择性好，分离效果好； 对热敏性物质破坏小，且耗能低； 生产能力大，周期短； 便于连续操作，容易实现自动化控制等。应用：适用于抗生素等小分子物质的分离纯化定义：是利用萃取目标物质在两种互不相溶的溶剂中溶解度的不同，使其从一种溶剂转入另一种溶剂从而实现分离。1. 溶剂萃取在溶剂萃取中，被提取的溶液称为料液，从料液中提取出来的物质称为溶质，用来进行萃取的溶剂称为萃取剂，溶质转移到萃取剂中与萃取剂形成的溶液为萃取液，被萃取出溶质的料液称为萃余液。 （1）生产中萃取操作一般应包括下面三个过程： 混合料液和萃取剂密切接触； 分离萃取相与萃余相分离； 溶剂回收萃取剂从萃取相(有时也需从萃余相)中除去，并加以回收。萃取操作流程分为单级萃取和多级萃取，多级萃取又分为多级错流萃取和多级逆流萃取。（2）溶剂的选择萃取用的有机溶剂应对产物有较大的溶解度和良好的选择性。遵循一个简单的规律：“相似物容易溶解在相似物中”，即分子的极性。极性液体互相混和并溶解盐类和极性固体，而非极性化合物溶剂是低极性或没有极性的液体。选择溶剂时还应注意： 与料液的互溶度应尽可能小； 毒性低； 化学稳定性高，腐蚀性低，挥发性小； 价格便宜，来源方便，便于回收。工业上常用的溶剂：乙酸乙酯、乙酸戊酯和丁酯等。（3）水相条件的影响pH值：直接影响表观分配系数。另外对选择性有影响。 温度：温度会影响生化物质的稳定性，所以一般在室温或低温下进行。同时影响分配系数K和萃取的速度。盐析：硫酸铵、氯化钠等可降低产物在水中的溶解度，还能减小有机溶剂在水相中的溶解度。带溶剂：能和产物形成复合物，使产物更易溶于有机溶剂相中，提高分配系数。（4）乳化和去乳化定义：乳化是一种液体(分散相)分散在另一种不相混溶的液体(连续相)中的现象。害处：乳化产生后会使有机溶剂相和水相分层困难，产生乳化后使有机相和水相分层困难。原因：是发酵液中存在的蛋白质和固体颗粒等物质，这些物质具有表面活剂性的作用，使有机溶剂和水的表面张力降低，水易于以微小液滴的形式分散于油相称为油包水型W/O乳浊液；相反，为O/W型乳浊液。乳化方法： a. 过滤或离心分离破乳法； b. 化学法：加电解质中和离子型乳油液的电荷； c. 物理法：加热、稀释、吸附等； d. 顶替法：加入表面活性更大，但因其碳链较短难以形成坚固的保护膜的物质，取代界面上的乳化剂； e. 转型法：如在O/W中加入亲油性乳化刑，使乳化液有生成W/O的倾向，但又不稳定，从而达到破乳目的。最好的方法是防止乳化，如蛋白质是乳化起因，就应设法去除蛋白质。去乳化：破坏乳浊液（5）萃取的方式根据混合- 分离的操作方式，可以分为单级萃取和多级萃取。单级萃取：只使用一个混合器和一个分离器的萃取。 特点：流程最简单，单收率不高。F：料液S：溶剂L：萃取液R：萃余液多级错流萃取：每级都加入新鲜萃取溶剂，溶剂消耗多，萃取液产物平均浓度较稀，但萃取较完全。多级错流萃取（F料液；S溶剂；L萃取液；R萃余液） 多级逆流萃取：料液走向与萃取走向相反，萃取剂只在最后一级加入，萃取剂消耗少，萃取液产物平均浓度高，产物收率最高。多级逆流萃取 2. 双水相萃取法定义：利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。（1）双水相形成大多数亲水性聚合物水溶液与第二种亲水性聚合物混合，达到一定浓度时，会产生两相，两种高聚物分别溶于互不相溶的两相中。高聚物之间的不相溶性，使得它们无法相互渗透，不能形成均一相，从而具有相分离的倾向，在一定条件下，即能分为两相。聚合物与盐类溶液也能形成两相。典型的两水相系统几种典型的双水相系统（2）影响双水相分配的因素成相聚合物的先对分子质量成相聚合物的浓度盐的种类和浓度pH温度（3）双水相萃取的应用可用于分离和纯化酶、核酸、生长素、病毒、干扰素等。常用的双水相系统为聚乙二醇/葡聚糖和聚乙二醇/无机盐，后者中聚乙二醇/硫酸盐或磷酸盐系统最为常用。目的分子与杂质（如细胞等）应分配在不同的相。分配系数应足够大。容易离心分离。（4）两水相分离条件3. 反胶团萃取定义：利用表面活性剂在有机溶剂中自发形成的内含亲水微环境的反胶团，使生物分子溶于此亲水微环境，进而进行萃取的分离方法。若将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其浓度超过某一临界浓度，便会在有机溶剂内形成聚集体，称为反胶束。在反胶束中，表面活性剂的非极性基团在外与非极性的有机溶剂接触，而极性基团则排列在内形成一个极性核。此极性核具有溶解极性物质的能力，极性核溶解于水后，就形成了“水池”。反相胶团萃取的优点：成本低选择性高操作方便放大容易萃取剂 (反胶团相 )可循环利用蛋白质不易变性等优点。3. 超临界流体萃取定义：是将超临界流体作为萃取剂，从固体或液体中萃取出某些高沸点或热敏性成分，达到分离和提纯目的。超临界流体是物质处于临界温度、临界压力之上的一种流体状态，兼有气体、液体两重性的特点，即密度接近液体，而黏度和扩散系数与气体相似。不仅具有与液体溶剂相当的萃取能力，而且具有传质扩散速度快的优点。 具有较高的扩散性，从而减小了传质阻力，这对多孔疏松的固态物质和细胞材料中的化合物的萃取特别有利。对改变操作条件(如压力、温度)特别敏感，这就提供了操作上的灵活性和可调性。具有低的化学活性和毒性。（1）超临界流体具有以下特点：超临界CO2成为目前最常用的萃取剂，它具有以下特点： 1. CO2临界温度为31.1，临界压力为7.2MPa，临界条件容易达到。 2. CO2化学性质不活波，无色无味无毒，安全性好。 3. 价格便宜，纯度高，容易获得。因此，CO2特别适合天然产物有效成分的提取。（2）超临界CO2的特点：（3）应用超临界萃取技术具有低能耗。无污染和适用于分离易受热分解的高沸点物质的优点。最适用于分离价值高、难于用常规方法分离的生物化合物。除了用在化工、医药等行业外，还可用在烟草、香料、食品等方面。超临界流体萃取过程由萃取阶段与分离阶段组成分离（4）超临界萃取典型流程等温法：等温条件下，萃取相减压、膨胀，溶质从分离槽下部取出。气体经压缩机加压后返回萃取槽。等压法：等压条件下，萃取相加热、升温，气体和溶质分离。溶质从分离槽下部取出，气体冷却、压缩后回到萃取槽。吸附法：溶质被分离槽中的吸附剂吸附，气体压缩后回到分离槽。等温法（T1=T2，P1P2） 等压法（T1T2，P1=P2） 吸附法（T1=T2，P1=P2） 三、膜分离法定义：是物质通过膜的传递速度不同而得到分离。优点：过程一般较简单，操作方便，费用较低，效率较高，无相变，可在常温下操作，既节能又特别适用于热敏性物质的分离纯化，便于维修，有利于生产自动化的推广与普及。1. 膜分离方法的分类透析超滤反渗透微滤电渗析液膜技术气体渗透渗透蒸发（1）微滤：微孔过滤，利用孔径0.025m14m的多孔膜，过滤含有微粒的溶液，将微粒从溶液中除去，达到净化、分离和浓缩的目的。推动力为压力差，通常为0.1MPa0.5MPa。（2）超滤：滤膜孔径为lnm20nm，用于过滤含有微粒和大分子的溶液。以压力差为推动力，通常为0.1MPa0.6MPa。（3）反渗透：用反渗透膜(孔径0.1nm1nm)，对溶液施加压力，使溶剂通过反渗透膜，截留所有可溶物而得到分离的操作。反渗透也是以压力差为推动力，操作压达3MPa10MPa。2. 膜的材料、结构和性能参数膜的要求：透过速度大，选择性高，非特异性吸附低，机械强度好，不易被微生物侵袭，耐热、可高温灭菌，耐化学试剂，廉价等。（1）制膜的材料 种类：天然高分子材料、合成高分子材料和特殊材料。实际应用中，目前以纤维素膜和聚砜膜使用最广。（2）表征膜性能的参数孔径的性质(包括孔径、孔径分布和孔隙度)水通量截留率和截断分子量抗压能力pH适用范围对热和溶剂的稳定性。3. 膜的污染与清洗污染：膜在使用中，尽管操作条件保持不变，但通量仍逐渐降低的现象。原因：膜与料液中某一溶质的相互作用，或吸附在膜上的溶质和其它溶质的相互作用而引起的。 （1）膜的污染膜的清洗方法 a. 机械方法：加海绵球，增大流速，逆洗（对中空纤维超滤器），脉冲流动，超声波等。 b. 化学方法：水、盐溶液、稀酸、稀碱、表面活性剂、螯合剂、过氧化氢、酶溶液等清洗剂。（2）膜的清洗减轻膜污染的方法 a. 对料液进行预处理 b. 制模时改变膜的表面极性和电荷 （3）过滤方式与装置膜过滤的方式有常规过滤和切向过滤两种。膜分离设备： 平板式膜器 管式膜器 螺旋卷式膜器 中空纤维膜器（4）膜分离技术的应用：菌体、细胞的分离和收集；小分子产物的纯化，如抗生素、柠檬酸等；大分子产物的纯化，主要是酶制剂等；纯水的制备；纯净水和最终制品中的除菌和除热源。作膜反应器中的分离部件。四、吸附法定义：利用不同组分（溶质）在吸附剂表面吸附和解吸能力的差异进行分离的方法脱附：吸附的逆过程 吸附过程通常包括：待分离料液与吸附剂混合、吸附质被吸附到吸附剂表面、料液流出、吸附质解吸回收等四个过程。常用于从稀溶液中将溶质分离出来，由于受固体吸附剂的限制，处理能力较小；对溶质的作用较小，这一点在蛋白质分离中特别重要；可直接从发酵液中分离所需的产物，成为发酵与分离的耦合过程，从而可消除某些产物对微生物的抑制作用；溶质和吸附剂之间的相互作用及吸附平衡关系通常是非线性关系，故设计比较复杂，实验的工作量较大。1. 吸附法的特点：优点：有机溶剂掺入少 操作简便，安全，设备简单 pH变化小，适于稳定性差的物质缺点：选择性差收率低无机吸附剂性能不稳定不能连续操作，劳动强度大碳粉等吸附剂有粉尘污染2. 吸附机理固体的表面性质固体表面分子（或原子）所处的状态与固体内部分子（或原子）所处的状态不同。固体表面分子(或原子)处于特殊的状态。固体内部分子所受的力是对称的，故彼此处于平衡。但在界面分子的力场是不饱和的，即存在一种固体的表面力，它能从外界吸附分子、原子、或离子，并在吸附表面上形成多分子层或单分子层。 实际过程中物理和化学吸附是主要的，比较如下2. 吸附的类型：（1）疏水或非极性吸附剂（2）亲水和极性吸附剂（3）各种离子交换剂多孔型：活性炭、硅胶、硅藻土；大网格吸附剂：有机高分子材料，如聚苯乙烯，聚酯。凝胶型：纤维素凝胶，琼脂糖凝胶，匍聚糖凝胶等。吸附分离介质（1）吸附树脂指的是一类高分子聚合物。常用的有聚苯乙烯树脂和聚丙烯酸酯树脂等。吸附树脂品种很多，单体的变化和单体上官能团的变化可赋予树脂以各种特殊的性能。（2）吸附树脂可分为非极性、中极性、极性及强极性四类。（3）吸附树脂可用于除去废水中的有机物，糖液脱色，天然产物和生物化学制品的分离与精制等。吸附树脂1)组成结构：有机高分子聚合物的多孔网状结构2)特点：选择性好；解吸容易；机械强度好；流体阻力较小；价格高3）类型：非极性吸附剂芳香族（苯乙烯等） 中等极性吸附剂脂肪族（甲基丙烯酸酯等） 极性吸附剂含硫氧、酰氨、氮氧等基团吸附、冲洗 和 洗脱时间/体积y吸附冲洗洗脱吸附过程的影响因素1. 吸附剂的特性（组成结构、容量、稳定性 ）2. 吸附物的性质（熔点、缔合、离解、氢键等）3. 溶剂（单、混合）4.吸附操作条件1）温度2）pH值3）盐的浓度应用： 大孔吸附树脂广泛应用于制药及天然植物中活性成分如皂甙、黄酮、内脂、生物碱等大分子化合物的提取分离。 对人参皂甙、三七皂甙、淫羊藿黄酮、大豆异黄酮、茶多酚、洋地黄强心甙、麻黄精粉、柚甙、红豆杉生物碱、多种天然色素、中药复方药物提取等以及生物化学制品的净化、分离、回收都有良好的效果。 并在抗生素、维生素、氨基酸、蛋白质提纯，生化制药方面有很广泛的应用。五、离子交换法定义：利用溶液中离子与离子交换树脂的活性离子交换时结合力大小不同而进行分离的方法。对离子与非离子物质，离子化合物之间的分离，离子交换法是最重要的手段之一。离子交换法分离效率高，分离容量大，但分离周期长，在分析测试中，通常用于解决较困难的分离问题。树脂离子交换分离 离子交换纤维素和离子交换葡聚糖离子交换剂应满足的基本条件： 有高度的不溶性，即在各种溶剂中不发生溶解； 有疏松的多孔结构或巨大的表面积，使交换离子能在交换剂中进行自由扩散和交换； 有较多的交换基团； 有稳定的物理化学性质。在使用过程中，不因物理或化学因子的变化而发生分解和变形等现象。 1. 离子交换树脂的类型离子交换树脂由三部分组成：骨架：由不溶性惰性高分子聚合物构成，内部呈三维网装结构，有许多空。功能基团：共价键结合于骨架上，不能移动；活性离子：以离子键与功能团连接，带有与功能团相反的电荷。2.常用的离子交换树脂（1）强酸性阳离子交换树脂：活性基团是-SO3H（磺酸基）和-CH2SO3H（次甲基磺酸基）；（2）弱酸性阳离子交换树脂：活性基团有-COOH, -OCH2COOH, C6H5OH等弱酸性基团；（3）强碱性阴离子交换树脂：活性基团为季铵基团，如三甲胺基或二甲基-羟基乙基胺基；（4）弱碱性阴离子交换树脂：活性基团为伯胺或仲胺，碱性较弱；3.离子交换树脂的命名和型号（1）命名（2）型号 离子交换产品的型号以三位阿拉伯数字组成，第一位数字代表产品的分类，第二位数字代表骨架的差异，第三位数字为顺序号用以区别基因、交联剂等的差异。分类代号和骨架代号强酸性 （001-099）弱酸性（100-199）强碱性 （200-299)弱碱性 （300-399）X 后面交联度（对凝胶型离子交换树脂）对大孔型离子交换树脂，在型号的前面加“”表示。离子交换树脂命名 离子交换树脂命名 交联度数值顺序号骨架代号分类代号分类代号顺序号分类代号骨架代号大孔型代号0010017交联度为7%的苯乙烯系凝胶型强酸性阳离子交换树脂315大孔型丙烯酸弱碱性阴离子交换树脂大孔型凝胶型3. 离子交换树脂的理化性能（1）对树脂的一般要求： 机械强度：膨胀度大，交联度小的树脂强度差 化学稳定性：主要指耐化学试剂、耐氧化、耐辐射的性能。 大小及形状：制成球形，其直径为0.2-1.2mm。球形的优点是增大比表面积、提高机械强度和减少流体阻力。 色泽：普通凝胶型树脂是透明的球珠，大孔树脂呈不透明的雾状球珠。随合成原料、工艺条件不同，树脂的颜色也有所不同，一般有黄、白、黄褐、红棕等几种颜色。 （2）树脂理化性能颗粒度；交联度；孔度、孔径、比表面积；交换容量；颗粒度树脂颗粒的大小和形状对树脂的交换能力、树脂层中溶液流动分布的均匀程度、溶液通过树脂层的压力及交换和反冲时树脂的流失等有重要影响。常用树脂的粒度为20-60目。交联度交联度：交联剂在树脂单体总量中所占质量分数称为交联度。一般交联度为4-14，常见为8。其中交联度的影响有：a. 网状结构的紧密度 b. 孔径大小 c. 交换速度 d. 选择性特点：一般说来，交联度越大，树脂越坚固，在水中不易溶胀，含水量低。而交联度减少，树脂变得柔软，容易溶胀。孔度、孔径、比表面积孔度：指每单位质量或体积树脂所含的孔隙体积，以mL/g或mL/mL表示。孔径大小对离子交换树脂的选择性影响很大，特别是对有机大分子。比表面积与树脂的吸附量和交换速度有关。交换容量交换容量是表征树脂活性基团数量交换能力的重要参数，总交换容量：每克干树脂上活性功能团的总数（3-6mM/g干）工作交换容量（实用交换容量）：即在某一指定的应用条件下树脂表观出来的交换容量，流出液中被交换离子含量达到漏出点的交换容量 （1）离子交换剂的选择 任何一种离子交换剂都不可能适用于分离所有的样品。因此，选择理想的离子交换剂是提高有效成分的得率和分辨率的一个重要环节。5. 树脂和操作条件的选择阴、阳离子交换剂的选择 如果被分离物质带正电荷，应选择阳离子交换剂；如果被分离物质带负电荷，则应选择阴离子交换剂；如果被分离物质为两性离子，要按照其稳定状态的净电荷来选择交换剂。假设一蛋白质的等电点为5，若该物质在pH5-8稳定时，应选择阴离子交换剂；若该物质在pH5以下稳定时，则可选择阳离子交换剂。 强、弱离子交换剂的选择 一般来说，强离子交换剂适用的pH范围很广。所以常用它来制备无离子水和分离一些在极端pH溶液中解离且较稳定的物质。 而弱性离子交换剂适用的pH范围较窄，在pH为中性的溶液中交换容量也高，用于分离生物大分子物质时，其活性不易丧失。所以，分离生物样品多采用弱离子交换剂。 （3）反离子的选择 离子交换剂处于电中性时往往带有一定的反离子。为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子。 所以，强阳性和强阴性离子交换剂应分别选择H型和OH型；弱酸性和弱碱性离子交换剂应分别选择Na型和Cl型。 （4）基质的选择 树脂基质是疏水性化合物，而纤维素、葡聚糖和琼脂糖基质则是亲水性化合物。在分离生物大分子时，亲水性基质交换容量高，且对生物大分子物质的吸附和洗脱都比较温和，被分离物质活性不易受到破坏。 要恰当地选择离子交换剂，必须对被分离物的性质和所处溶液组分及酸碱度等因素进行全面分析。综合考虑上述4个方面，选择的离子交换剂才能成功地分离样品。 四类树脂的特性比较（1）树脂的选择及其处理树脂的处理：一般经过晾干；研磨；洗涤；溶胀的步骤。5. 离子交换实验技术（2）装柱与装样交换装柱：树脂洗至中性后借助水的重力使树脂自然沉积， 避免夹杂气泡现象。装样交换：装样前，柱要预饱和。（3）洗 脱洗脱一般采取分步淋洗或梯度淋洗，其中分步洗脱，是指先采用洗脱能力较弱的溶液，使易洗脱组分流出，然后依次使用洗脱能力更强的溶液，洗脱较难洗脱的组分。（4）树脂的再生第四节 发酵产物的纯化发酵产物经初分离后，除去不少杂质，体积也大为缩小，但纯度仍达不到要求，需要进一步的纯化。大分子产物的纯化主要用层析法，特别是液相层析法，而小分子产物的纯化则主要用结晶法。一、液相层析定义：指流动相为液体的层析方法，按固定相不同又可分为两类：（1）固定相为固体的称为液-固层析；（2）固定相为液体的称为液-液层析。特点：分离效率高，设备较简短，操作方便，条件温和，在操作过程中生物活性物质不易变性失活，且操作方法和条件多样，适于多种物质的分离，因而在生物分离领域得到了广泛应用。液相层析装置的基本配置泵检测记录收集器柱分步收集器仪器设备简介1. 离子交换层析定义：利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力不同，经过交换平衡达到分离的目的的一种柱层析法。在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行。 优点：灵敏度高，重复性、选择性好，分析速度快等优点，是当前最常用的层析法之一。（1）离子交换剂的组成结构及其特性（2）离子交换树脂的形状结构示意图示意图（离子交换过程）电离基团（磺酸根）可交换离子（钠离子）交换离子不交换离子三、离子交换柱层析原理示意图柱层析系统的组装线性和阶梯式梯度溶液分离牛血清白蛋白的图谱2. 凝胶过滤层析凝胶过滤法又称为分子筛层析，是利用凝胶的网状结构为i固定相，根据分子大小进行分离的一种方法。凝胶过滤所用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的网状结构。单个凝胶珠本身象“筛子”，不同类型凝胶的筛孔的大小不同。Services 基本原理凝胶过滤层析过程示意图 （1）要分离的分子分为三类： A类：dA最大孔径，全排阻（出） 凝胶对它无阻滞，最早流出； C类：dC最小孔径，能进入全部孔隙区，阻滞最大，流速最慢，最晚流出； B类：最小孔径dB最大孔径，进入部分孔隙区大小不同B类分子之间阻滞不同，可以分离把B类分子的分离称为分级分离BB把A、B、C类分子间分离称为组别分离A B C典型的凝胶类型交联葡聚糖凝胶：Sephadex聚丙烯酰胺凝胶：Sephacryl 琼脂糖凝胶：Sepharose和Bio-Gel其它：有机凝胶Sepharon，交联聚醚Toyopeal，纤维素凝胶，改性刚性填料等。3. 亲和层析定义：利用生物分子物质具有的特异的亲和力而进行分离的一种层析技术 。许多生物大分子具有与其结构相对应的特异分子可逆结合的特性，如抗原与抗体、酶与底物或抑制剂、激素与受体等，这种结合往往是特异的而且是可逆的，生物大分子间的这种结合力称为亲和力。（1）亲和层析的基本特点纯化过程简单、迅速，且分离效率高特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子纯化倍数大，产物纯度高必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件价格相对较昂贵；在洗脱中，交联在层析介质上的配基可能脱落并进入产品中，从而造成不良影响，如抗体、染料等配基。选择并制备合适的亲和吸附剂是亲和层析能否取得成功的关键之一。它包括基质和配体的选择、基质的活化、配体与基质的偶联等。根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为两类：特异性配体和通用性配体。特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的配体。如生物素和亲和素、抗原和抗体、酶和它的抑制剂、激素受体等，它们结合都具有很高的特异性，用这些物质作为配体都属于特异性配体。配体的特异性是保证亲和层析高分辨率的重要因素。通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大分子结合的配体，如各种凝集素可以结合各种糖蛋白，核酸可以结合RNA、结合RNA的蛋白质等。通用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特异性配体，但通过选择合适的洗脱条件也可以得到很高的分辨率。通用配体还具有结构稳定、偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便宜等优点，所以在实验中得到了广泛的应用。基质一般不能直接与配体连接，偶联之前需要活化。基质的活化是指通过对基质进行一定的化学处理，使基质表面表面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。不同的基质有不同的活化方法。亲和层析纯化生物大分子通常采用柱层析的方法。（2）洗脱方法 非特异性洗脱：改变缓冲液的pH、离子强度、介电常数或温度使物质构象改变，浓缩、洗脱后立即中和稀释或透析，使蛋白质迅速恢复到天然结构 特异性洗脱：再次利用生物学特异性只洗脱和配基专一作用的酶，不洗脱由于非专一吸附上去的杂蛋白，特异性强。（3）再生 亲和层析拄可在一次层析后用大量洗脱剂连续洗涤，然后再用平衡缓冲液平衡，经处理后的层析柱能再次使用。（4）亲和层析的应用 分离和纯化 分辨化学或遗传学上修饰的酶 纯化亲和标记的活性中心肽段和蛋白质结构研究 纯化人工合成的多肽和蛋白质 解释酶作用机理二、结晶