无公害蔬菜中亚硝酸盐的监测(检查后的).doc

扬州大学本科生毕业设计目 录摘要1前言21材料与方法51.1.1 原料51.1.2 试剂51.1.3 主要仪器51.2 实验原理：61.3 试验流程61.4 试验步骤61.4.1 样品的采集与预处理61.4.2 待测液的制备与提取61.5 试验方法71.5.1 亚硝酸盐标准曲线的绘制71.5.2 显色后生成络合物的稳定性71.5.3 样液测定方法71.5.6 不同提取方法的比较71.5.7 各类无公害蔬菜检测结果81.6 计算82 结果与分析.92.1 亚硝酸盐标准曲线.92.2 显色时间对络合物的稳定性的影响102.3 活性炭对试验结果的影响102.4 不同提取方法对结果的影响112.5 准确度实验112.6 无公害蔬菜样品的测定113.小结与讨论14参考文献.15致谢.16超声提取法在无公害蔬菜亚硝酸盐监测中的应用学生姓名：黄海锋 班级：营养0601班 指导老师：黄玉军摘要：本文对检测无公害蔬菜中亚硝酸盐的前处理条件进行了一定的讨论。由实验得出：提取液中加入1g活性炭，超声波10min时提取效果最佳，回收率最高。同时采用该前处理条件处理各类无公害蔬菜，对蔬菜进行监测，结果显示所有蔬菜的亚硝酸盐含量均远低于国家限量标准。关键词：无公害蔬菜 亚硝酸盐 监测Application of ultrasonic extraction in the monitoring of nitrite about Pollution-free vegetablesAbstract: This article discussion the conditions of nitrite treatment detection about pollution-free vegetables. Obtained from the experiment: leaching solution has the best result and the highest rate when adding extract 1g activated carbon and ultrasonic extraction 10min.At the same time using the pre-conditions for handling and monitoring all types of vegetables, and the results show that the nitrite content of all vegetables are much lower than the national limit standard.Key words: Pollution-free vegetables, nitrite, monitor前 言蔬菜是人们日常生活中必不可少的重要副食品，蔬菜可以为人类提供各类营养物质，包括各种维生素、矿物质、纤维素、芳香油和有机酸等营养物质。人体必需的维生素C的90、维生素A的60来自蔬菜，可见蔬菜对人类健康的贡献。此外，蔬菜中还有多种多样的植物化学物质是人们公认的对健康有效的成分，如：类胡萝卜素、二丙烯化合物、甲基硫化合物等，它们对人体的贡献不可小觑。当然，人类对于蔬菜的作用还有待于进一步的研究和发现。目前某些研究表明，蔬菜中含有对于预防慢性、退行性疾病有益的一些物质。随着经济的快速发展和社会的不断进步，人们生活水平的不断提高，消费者的消费观念发生了根本性变化，人们对蔬菜质量的要求越来越高。当前蔬菜生产中的质量问题是人们关心的话题，农药、化肥等农用化学产品的大量使用，对蔬菜的产量增加起到了一定的作用，但同时对蔬菜的品质产生了化学污染，农业环境污染的日趋严重，以及蔬菜贮运加过程中的二次污染，也影响着蔬菜的质量。如何发展无公害蔬菜，今后进一步发展到绿色蔬菜、有机蔬菜，全面提高“菜篮子”产品质量卫生安全水平，让城乡居民长期吃上“放心菜”，是新阶段“菜篮子”工作的主要任务，是生产者追求的目标，是消费者消费的热点，也是蔬菜发展的方向1。无公害蔬菜是指产地环境、生产过程、产品质量符合有关国家或农业行业无公害标准的要求，并经产地或市场质量检测机构检验合格，经有关部门认证后使用无公害农产品标识销售的蔬菜产品。无公害蔬菜允许有限量地使用农药、化肥等化学合成物质，但只要蔬菜体内农药、化肥残留量及其它有害物质的含量不超过国家、地方或出口允许标准，不对环境产生污染2 。它与目前常见的绿色蔬菜、有机蔬菜的区别在于：无公害蔬菜是蔬菜安全性的最低要求，而绿色蔬菜安全性较高、有机蔬菜安全性最高。近年来，蔬菜亚硝酸盐污染情况已越来越受到人们的关注。亚硝酸盐和硝酸盐广泛存在于土壤、水域及植物中，如绿色蔬菜中的甜菜、莴苣、菠菜、芹菜及萝卜等硝酸盐含量较高，硝酸盐在某些细菌的还原作用下可变成亚硝酸盐。目前广泛采用的含氮农药、化学氮肥及含氮工业废水、废渣对环境土壤和水造成污染，使蔬菜中亚硝酸盐含量不断增加。而土壤则是水体、植物性食品亚硝酸盐的主要来源。蔬菜中的亚硝酸盐很可能是比农药危害更大的一种成分。虽然硝酸盐对人体没有直接毒害作用，但它在人体内的酶和微生物作用下可转变为有毒的亚硝酸盐，使血液的输氧能力下降，从而导致高铁血红蛋白症3 。另外，亚硝酸盐还可与胃肠中的次级胺结合生成强致癌物亚硝酸胺，可诱发人体消化系统的癌变4 。因此，控制亚硝酸盐的摄入量，对于维护人体健康至关重要。调查发现，我国膳食中80%左右的亚硝酸盐来自蔬菜。食入200mg-500mg的亚硝酸盐即可引起中毒，1g-2g就会引起死亡5。所有蔬菜中都或多或少存在亚硝酸盐，源于过量施用的硝态氮肥。蔬菜在施用过多的硝酸铵和其他硝态氮肥后，未被蔬菜吸收利用的过剩硝态氮则以硝酸盐的形式储藏在蔬菜中，硝酸盐在其后的贮藏、加工、食用的过程中，在细菌的作用下转化为亚硝酸盐，如绿叶蔬菜中的莴笋、菠菜、萝卜等最为严重6。亚硝酸盐对人体的危害是如此之大，因此对蔬菜中亚硝酸盐的监测就尤为关键，而监测的前提是怎样高效地将亚硝酸盐从蔬菜中提取出来，本文利用超声设备辅助提取蔬菜中亚硝酸盐得到较好的效果。超声波是频率在20kHz-50MHz的声波，它的频率比通常讲的声波的频率要高很多，因此超声波具有一些特有的性能：机械作用、热作用。超声波提取过程是一个物理过程，浸提过程中无化学反应发生，被浸提的化学成分的结构和性质不会发生变化，因而超声波的振动作用提高了提取速度，缩短了提取时间，促进了化学成分向溶剂中溶解，所以用超声波提取化学成分可大大地缩短提取时间，提高提取率，得到的化学成分结构和性质也不会改变。超声波在媒质中传播，其振动能量不断被媒质吸收转变为热能而使自身温度升高。声能被吸收可引起媒质中的整体加热、边界外的局部加热和空化形成激波时波前处的局部加热。超声波的力学效应赋予溶剂对细胞膜更大的渗透力，并强化细胞内外的质量传输。超声波形成的微流效应也是其提高提取过程的一个重要原因7-9。最近，在食品安全这一新兴的研究领域中，超声提取以其快速、高效、对待测物含量影响较小等特点得到了研究者的青睐，并对其在防腐剂及农药提取等方面的应用进行了初步的探索10。毋庸置疑，超声提取技术势必将在痕量、微量成分提取，功能性物质的提取，特别是与食品安全分析检测有关的样品提取过程中有更广阔的应用前景。蔬菜中抗坏血酸的存在对亚硝酸盐的测定会带来严重的干扰。因此，必须采取相应的措施以消除干扰，活性炭对抗坏血酸具有很好的吸附作用，在提取样品中的亚硝酸盐时加入活性炭，可以将溶液中的抗坏血酸吸附，从而避免抗坏血酸对亚硝酸盐的干扰11。本试验采用超声波提取法提取无公害蔬菜中的亚硝酸盐，利用活性炭吸附对检测蔬菜亚硝酸盐有干扰的抗坏血酸以及一些色素类物质，采用盐酸萘乙二胺法检测多种无公害蔬菜中的亚硝酸盐含量，对无公害蔬菜进行进入市场前的监测，保证无公害蔬菜的质量安全，为人们食用安全的无公害蔬菜提供品质保证。1材料与方法1.1实验材料和试剂1.1.1 原料各种无公害蔬菜（采自扬州市绿扬现代生态农业发展有限公司）。1.1.2 试剂亚硝酸钠标准储备液200mg/L：准确称取0.1000g于110-120干燥恒重的亚硝酸钠，加水溶解移入500mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。此溶液每升相当于200mg的亚硝酸钠。亚硝酸钠标准使用液5mg/L，临用前现配：吸取亚硝酸钠标准液5.00mL，置于200mL容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液每升相当于5.0mg亚硝酸钠。饱和硼砂溶液(50g/L)：称取5.0g硼酸钠，溶于100mL热水中，冷却后备用。质量分数为10. 6 %亚铁氰化钾溶液(106g/L)：称取106.0g亚铁氰化钾，用水溶解，并稀释至1000mL。质量分数为22 %乙酸锌溶液(220g/L)：称取220.0g乙酸锌，先加30mL冰乙酸溶解，用水稀释至1000mL。活性炭粉末：分析纯。对氨基苯磺酸溶液(4g/L)：称取0.4g对氨基苯磺酸，溶于100mL20%盐酸中，置棕色瓶中混匀，避光保存。盐酸萘乙二胺溶液(2g/L)：称取0.2g盐酸萘乙二胺，溶解于100mL水中，混匀后，置棕色瓶中，避光保存。以上均为分析纯试剂，实验过程中均使用电阻率小于18.2M/ cm2 的超纯水。 1.1.3 主要仪器电子天平 北京赛多利斯科学仪器有限公司KQ3200型超声波清洁器 昆山市超声仪器有限公司SHB-循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司DGF30/7-A型电热鼓风干燥箱 南京实验仪器厂 Spectrumlab755s紫外可见分光光度计 上海棱光技术有限公司九阳料理机 山东九阳小家电有限公司DK-S26型电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司1mL、5mL移液枪 上海求精生化试剂仪器有限公司海尔电冰箱 青岛海尔股份有限公司美的电磁炉 广东美的生活电器制造有限公司SZ-93自动双重纯水蒸馏器 上海亚荣生化仪器厂1.2 实验原理：在弱酸性条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，此染料的颜色的深度与溶液中亚硝酸钠的含量成正比。在538nm处为最大吸收波长。反应式如下：1.3 试验流程采集无公害蔬菜清洗晾干匀浆称量加入活性炭，超声波提取静置真空泵减压抽滤吸取滤液加入显色剂检测数据处理1.4 试验步骤1.4.1 样品的采集与预处理采集：样品采集自扬州市绿扬现代生态农业发展有限公司，按国家环保局颁发的环境监测分析方法中植物样品采集方法进行。据无公害蔬菜生产基地地形分片布点, 按梅花形或蛇形法采集蔬菜样品。每件样采集可食部分1公斤。所采样装入装有冰块的袋子中带回实验室处理。预处理：取叶类蔬菜的可食用部位，用自来水、蒸馏水分别洗涤三次，放在干燥处晾干备用或用滤纸擦干备用。1.4.2 待测液的制备与提取取预处理的蔬菜样品切碎，于料理机中打碎成匀浆。准确称取10.00 g匀浆样品于250mL锥形瓶中，加入饱和硼砂溶液5mL，纯水100mL，活性炭粉末1g，超声提取10min，然后将试液转入250mL容量瓶中，加入2mL亚铁氰化钾溶液和2mL质量分数为22 %的乙酸锌溶液沉淀蛋白质，用纯水定容至刻度，摇匀。静置10min后真空泵减压抽滤，得清亮待测液。1.5 试验方法1.5.1 亚硝酸盐标准曲线的绘制吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0，2.5mL5mg/ L亚硝酸钠标准使用液，分别置于10个50mL容量瓶中，加2mL对氨基苯磺酸溶液，摇匀，5 min后加1mL盐酸乙二胺溶液，用水定容至刻度，摇匀，静置15 min后用1cm比色皿以纯水为参比，于波长为538nm处测吸光度值。测定结果绘制成标准曲线。1.5.2 显色后生成络合物的稳定性样品中加入显色剂后所生成的络合物的稳定性随时间延长而发生变化。取相同浓度的亚硝酸盐进行显色，显色后在545 min每隔5 min测定1次吸光度。不同显色时间下的吸光度测定结果见下文。1.5.3 样液测定方法亚硝酸盐含量的测定采用盐酸萘乙二胺分光光度法12-13。准确吸取待测液40mL于50mL容量瓶中，加2mL对氨基苯磺酸溶液，摇匀，5min后加1mL盐酸萘乙二胺溶液，用水稀释至刻度，混匀，静置15min后用1cm比色皿以纯水为参比，于538 nm处测吸光度。根据吸光度计算亚硝酸盐含量。1.5.4 加标回收率试验 以生菜为例，分两组检测生菜中亚硝酸盐含量，一组直接检测生菜中的亚硝酸盐，另一组加入一定量的亚硝酸钠标准使用液后按照正常步骤处理样品，计算加入标准液后的回收率。1.5.5 活性炭加入量对提取结果的影响 样液中活性炭加入量对提取结果有一定的影响。本试验拟分5组即：以0、0.5、1.0、1.5、2.0g五种加入量，分别对提取液进行检测，同时做加标回收试验，检验方法回收率。1.5.6 不同提取方法的比较选择生菜作为供试蔬菜，对不同的样品提取技术进行比较，同时做加标回收试验。（1）国标提取法称取匀浆样品10.00g于250mL锥形瓶中，加入12.5mL饱和硼砂溶液，70水100mL，混匀，于沸水浴中加热15min，冷至室温。然后将试样转入250mL容量瓶中，加入2mL亚铁氰化钾溶液和2mL质量分数为22 %的乙酸锌溶液沉淀蛋白质定容，摇匀，静置10min后过滤，滤液待测。（2）振荡提取法称取匀浆样品10.00g于250mL锥形瓶中，加入5mL饱和硼砂溶液，70纯水100mL，粉末状活性炭1g，置于振荡器上振荡30min。再将试样转移到250mL容量瓶中，加入2mL亚铁氰化钾溶液和2mL质量分数为22%的乙酸锌溶液沉淀蛋白质，定容，摇匀。静置10min后过滤，滤液待测。（3）超声提取法称取10.00g匀浆样品于250mL锥形瓶中，加入5mL饱和硼砂溶液，纯水100mL，活性炭粉末1g，超声提取10min，然后将试液转入250mL容量瓶中，加入2mL亚铁氰化钾溶液和2mL质量分数为22%的乙酸锌溶液沉淀蛋白质，定容，摇匀。静置10min后过滤，滤液待测。1.5.7 超声时间的确定 选择5、10、15、20、30min作为超声提取时间，确定超声提取的最佳时间。1.5.8 各类无公害蔬菜检测结果 对所采集的各种无公害蔬菜按照上述方法进行检测，对检测结果汇总。1.6 计算1.6.1 样品中亚硝酸盐的含量：式中：X1样品中亚硝酸盐的含量（mg/kg）；m样品质量（g）；A1测定用样液中亚硝酸盐的质量（ug）；V0样品处理液总体积（mL）；V1测定取样液体积（mL）。1.6.2 样品加标回收率计算公式： 加标样品测定值样品测定值回收率（%） = 100% 加入标准品的量2. 结果与分析2.1 亚硝酸盐标准曲线2.1.1 实验步骤吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0，2.5mL5mg/ L亚硝酸钠标准使用液，分别置于10个50mL容量瓶中，加2mL对氨基苯磺酸溶液，摇匀，5 min后加1mL盐酸乙二胺溶液，用水定容至刻度，摇匀，静置15 min后用1cm比色皿以纯水为参比，于波长为538nm处测吸光度值。测定结果绘制成标准曲线。2.1.2 标准曲线的绘制 按照上述实验步骤测得的吸光度值绘制成图，结果见图1：图1. 亚硝酸盐标准曲线Fig 1. Standard curve of nitrite2.1.3 线性回归方程按实验方法，分别测定NO2-含量在0-0.3mg/L范围内显色体系的吸光度，结果处理后得线性回归方程为：y=0.6733x+0.003，相关系数：R2=0.9994由相关系数可知，该方法在00.3mg/L范围内线性关系良好，符合朗白比尔定律。根据回归方程，即可计算出待测液中NO2-的浓度。2.2 显色时间对络合物的稳定性的影响 取2mL 5 mg/ L NaNO2 标准使用液于25mL比色管中，按照1.5.3的方法进行显色，测定不同的显色时间下络合物的吸光度值。试验结果见图2：图2. 显色后生成络合物的稳定性Fig.2 Stability of complexing compound after diazotization 由图2可以看出络合物在45min内吸光度值比较稳定，考虑到实验时间，以及显色后的稳定性，因此选择显色时间为15min，所有样品应在显色50min内测定完毕，以保证数据的准确性和可靠性。2.3 活性炭对试验结果的影响本试验以生菜为例，取预处理的生菜样品切碎，于料理机中打碎成匀浆。准确称取10.00 g匀浆样品于250mL锥形瓶中，加入饱和硼砂溶液5mL，纯水100mL，活性炭的加入量分别为0g、0.5g、1g、1.5g、2g，超声提取10min，然后将试液转入250mL容量瓶中，加入2mL亚铁氰化钾溶液和2mL质量分数为22 %的乙酸锌溶液沉淀蛋白质，用纯水定容至刻度，摇匀。静置10min后真空泵减压抽滤，得清亮待测液。待测液按照1.5.3的方法检测，同时进行回收实验，实验重复3次，取平均值，结果见表1：表1. 活性炭加入量对结果的影响Tab 1. Activated carbon addition on the impact of the results 活性炭加入量（g）00.511.52亚硝酸盐含量(mg/kg)0.0420.0440.0460.0490.053加标量(mg/kg)0.040.040.040.040.04加标后测定值(mg/kg)0.0680.0740.08240.0830.088回收率(%)6575918587.5 由表1可以看出，加入1g活性炭时回收率为最高，加入1.5g、2g的效果虽没有加入1g时好，但效果也不错，同时考虑到节约试剂，因此选用加入1g的活性炭作为提取条件。2.4 不同提取方法对结果的影响 本试验以生菜为例，采用三种处理方法即国标法提取、振荡提取、和超声波提取，对样液进行处理，同时做加标试验，活性炭加入量为1g，样液检测按照1.5.3的方法进行，结果见表2：表2. 不同处理方法对结果的影响Table 2. Effects of different treatment methods on the results国标法振荡30min超声10minNO2-含量(mg/kg)0.0520.0400.035加标量(mg/kg)0.040.040.04加标后测定值(mg/kg)0.0780.0710.0724回收率(%)657893.5由表2可以看出不同的提取方式对蔬菜中亚硝酸盐的检测结果影响比较大，其中采用国标法提取的亚硝酸盐回收率最低，振荡法的亚硝酸盐回收率较低，而超声波提取法的亚硝酸盐回收率较高，并且热水提取和振荡提取所需时间均较长，而超声波提取所需时间较短且操作简便易行。所以超声波提取法为3种提取方法中最佳提取法。2.5 超声时间对结果的影响 由表2已经确定了超声提取的效果优于国标法的加热提取和振荡提取，但是具体的超声时间还不确定，本试验选择5、10、15、20、30min作为超声提取时间，选出提取效果最佳的超声时间。以生菜为例，处理步骤同1.5.3，重复3次试验，取平均值，结果见表3：表3. 超声时间对结果的影响Table 2. Affects of ultrasound time on the results超声时间（min）510152030亚硝酸盐含量(mg/kg)0.0430.0520.0510.0550.053加标量(mg/kg)0.040.040.040.040.04加标后测定值(mg/kg)0.0770.0900.0880.0920.089回收率(%)859592.592.390 由表3可以看出超声提取确实可以提高样品中亚硝酸盐的回收率，10min时回收率最高，超声10-30分钟时亚硝酸盐回收率也很高，跟超声10min的效果差不多，考虑到节约实验时间，同时保证实验结果的准确性，本实验最终选定样液超声10min作为最佳条件。2.6 准确度实验 以新鲜生菜作为样本本底加亚硝酸钠标准使用液，按前述实验方法处理，每个样品平行测定3次，测定NO2-的含量，计算方法的回收率，结果见表4：表4. 方法的回收率Tab.4 Recoveries of the method测定离子本底值(mg/kg)加标量(mg/kg)测定平均值(mg/kg)平均回收率(%)NO2-0.0350.040.072493.52.7 无公害蔬菜样品的测定利用上述建立的活性炭吸附抗坏血酸、色素等物质，超声波提取法，测定各类无公害蔬菜中亚硝酸盐的含量。2.7.1 叶菜类无公害蔬菜亚硝酸盐的测定采集基地生长的叶菜类无公害蔬菜，采用本试验建立的方法检测，检测结果见图3：图3. 叶菜类蔬菜亚硝酸盐含量Fig 3. Nitrite content in leafy vegetables由图3可以看出叶菜类蔬菜的亚硝酸盐总体的残留量比较低，其中菠菜和豌豆苗的亚硝酸盐残留量较高。2.7.2瓜果类无公害蔬菜亚硝酸盐的测定采集基地生长的瓜果类无公害蔬菜，采用本试验建立的方法检测，检测结果见图4：图4. 瓜果类蔬菜亚硝酸盐含量Fig 4. Nitrite content in melon vegetables由图4可以看出所检测的4种瓜果类蔬菜的亚硝酸盐的量比较高，但都远远低于国家规定的限量标准4mg/kg。因此所测的蔬菜是属于安全卫生的。2.6.3根茎类无公害蔬菜亚硝酸盐的测定采集基地生长的根茎类无公害蔬菜，采用本试验建立的方法检测，检测结果见图5：图5. 根茎类蔬菜亚硝酸盐含量Fig 5. Nitrite content in root vegetables由图5可以看出所检测的4种根茎类蔬菜的亚硝酸盐的量比较低，远远低于国家标准所规定的4mg/kg的限量标准，因此所检测的无公害蔬菜都是安全卫生的。3.小结与讨论（1）本文对无公害蔬菜的亚硝酸盐进行了检测，虽然硝酸盐对人体没有直接毒害作用，但它在人体内的酶和微生物作用下可转变为有毒的亚硝酸盐，使血液的输氧能力下降，从而导致高铁血红蛋白症。另外，亚硝酸盐还可与胃肠中的次级胺结合生成强致癌物亚硝酸胺，可诱发人体消化系统的癌变，因此亚硝酸盐的检测对于保证蔬菜的安全尤为重要。（2）本试验中对活性炭的加入量进行了探讨，经过试验得出活性炭的加入量为1g时，回收率最高，试验效果最好，因此本试验中活性炭的加入量为1g。（3）通过对蔬菜样品进行国标法、振荡提取法和超声提取法的预处理方法进行比较，建立了无公害蔬菜中亚硝酸盐的超声提取方法。超声提取法与国标方法相比准确度高、简便省时，可以用于大批量样品的处理检测。（4）采用本试验所改进的方法，即提取液中加入1g活性炭，超声提取10min，其它步骤按照正常方法处理，对蔬菜基地的多种蔬菜进行了检测，结果显示所有蔬菜均远远低于国家限量标准。符合无公害蔬