流式细胞术在出血与血栓性疾病中的应用课件

流式细胞术（flow cytometer，FCM） 在出血与血栓性疾病中的应用,安徽省立医院血液科 吴竞生,FCM在出血与血栓性疾病中的应用,集激光、电子物理、光电测量、计算机、细胞荧光化学 及单克隆抗体为一体的新技术。 对处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行快速、 灵敏、多参数定量分析和分选技术。 开创了对单个BPC或亚群分析的新途径。,FCM分析BPC的主要项目,血小板计数：CD41、CD61射门 网织血小板（RNA噻唑橙黄染料）：含RNA的BPC 自身抗体:特异性血小板抗体、PAIg、同种抗体 免疫表型分析：膜糖蛋白表达: GPIb/IX/V复合物(CD42a、CD42b、CD42c、CD42d) GPIIb/IIIa复合物（CD41、CD61）FV、IIIa BPC活化：膜糖蛋白表达（P-选择素，CD62p） BPC内物质，微粒对不同刺激剂的反应性：胞质钙流,FCM在出血性疾病中的应用,1、血小板减少：血小板数量、网织血小板 2、血小板功能缺陷 血小板无力症： GPIIb-IIIa（CD41- CD61） 巨大血小板综合征： GPIb-IX（CD42b-D42a 3、血小板抗体： 血小板相关免疫球蛋白（PAIg） 血小板糖蛋白特异性自身抗体（GP） 4 、血小板采集、储存与输注的监测.,出血性疾病的分类 血管壁功能异常 遗传性（毛细血管扩张症、家族单纯性） 获得性（过敏性紫癜、血管炎、免疫性） 数量 遗传性、 获得性 Aa 、巨核、免疫性、 ITP、DIC 血小板异常 数量 （ET，CML） 功能异常（GT、BS、颗粒性） 凝血功能障碍 遗传性（血友病、 VWD、其他凝血因子缺乏） 获得性（VK缺乏，肝脏病，DIC、药物） 循环中病理性抗凝物质 凝血因子抑制物 肝素样抗凝物质；狼疮样抗凝物 纤维蛋白（原）溶解亢进 遗传（t-PA/u-PA抗纤溶酶） 获得（DIC，血栓症）,血小板计数,BPC直径1-4m，与RBC，WBC或碎片、免疫复合物大小相等， 影响计数准确性。 FCM优点： 利用各种BPC特异性单克隆抗体直接标记荧光素分子 快速、准确，排除非BPC颗粒干扰，误差5% ， 尤其适合BPC20X109/L 重复性好 缺点：技术条件要求高，费用高。,FCM分析血小板原理,利用荧光素标记的BPC特异性单抗或与待测成分特异性结合 且能发荧光的物质 + 分离BPC或全血 去除未反应的单抗或荧光物质; 特异检测5000-10000 BPC光散射与荧光信号（单色或多色）; 获取, 统计数据, 分析, 根据光散射与荧光强弱 计算阳性BPC百分比或所测成分的含量（GP/BPC).,FCM分析血小板方法,抗凝血2ul 调节BPC 105-106/ml 2-80C 预冷的1% 多聚甲醛1ml固定，2h BPC特异单抗+荧光剂(异硫氰酸荧光素)(CD42b FITC) +SSC+FSC设门-特异性选择BPC. 检测10000-100000 BPC表面荧光信号. FCM获取，分析数据 结果表示: 平均颗粒荧光强度-活化时GP:Ag量 特异性荧光抗体结合阳性BPC% -x.,血小板光散射图,FCM分析血小板的客观评价,利用各种BPC特异性单克隆抗体直接标记荧光素分子 优点： 1、接近生理条件直接测定血小板: 2、微量（2ul) 3、快速、准确，排除非BPC颗粒干扰，误差5%，主观因素少 灵敏度高、尤其适合BPC20X109/L、重复性好 4、克服BPC小；环境影响（血管壁、剪切力、刺激剂变形、黏附、 聚集、释放、血小板活化与反应性 不足： 1、技术要求高,费用高。 2、不能反映与血管壁相互作用 ，,血小板功能缺陷,黏附异常 巨大血小板综合征 GP1b-FX 血管性血友病（vWD） vWF量、质异常 血小板型vWD GPIIb-FIX自发结合vWF 聚集异常 血小板无力症 GPIIb-IIIa缺乏 颗粒异常 灰色血小板综合症 颗粒储存异常或成分缺乏 储存池病 、致密体颗粒缺乏 受体与信号传递异常 环氧化酶缺乏症 环氧化酶缺乏 合成酶缺乏症 合成酶缺乏 信号传导缺陷症 花生四烯酸不能动员 膜磷脂异常,血小板膜糖蛋白分析,GP受体是血小板功能基础，分子结构或数量异常，可导致出血或血栓。 GPIIb/IIIa复合物(CD41/CD61) GP Ib/IX/V复合物(CD42a/CD42d) GPIa/IIa复合物(CD49b/CD29) GPIc/IIa复合物(CD49e/CD49f/CD29) GPIV(CD36) 2种单抗双色FCM： 一种单抗为血小板标志性抗体设定阈值（鉴别血小板）； 一种为检测抗体。,FCM分析血小板膜糖蛋白,荧光标记的抗BPC糖蛋白抗体(McAb)+GP特异性结合 FCM上测定结合荧光素的阳性BPC%与强度。 直接法或标记二抗间接法. 优点： 灵敏度高:可测BPC上微弱荧光强度。 特异性强: FS+SS与其他细胞、碎片区分 准确度高: 数万BPC 表示结果:% + 强度 操作: 简单，快速。,双色荧光分析血小板膜糖蛋白,血小板分化抗原及其单抗,FCM分析血小板膜糖蛋白临床应用,遗传性血小板功能缺陷： 黏附功能缺陷：巨血小板综合征（GPIb/IX/V复合物缺陷） 聚集功能缺陷：血小板无力症（ GPIIb/IIIa复合物缺陷） 储存池病：致密颗粒缺陷 血小板促凝活性异常：PF3缺乏； 活化的血小板不能结合Annexin V/FV/Va，FX/Xa 获得性血小板功能缺陷：肝、肾脏病、药物（ASA),GPIIb-IIIa,BPC活化 GPIIb-IIIa上Fg受体暴露 GPIIb-IIIa+Fg BPC聚集。 1，直接检测GPIIb-IIIa- GT 2，间接检测结合在BPC表面的Fg： FCM同时测GPIIb-IIIa+结合Fg: GPIIb-IIIa量正常+ Fg 结合能力 GPIIb-IIIa质异常-变异性GT 抗GPIIb-IIIa单抗检测简单、快速、敏感。 根据结合率判断纯合子与杂合子状态。,血小板无力症（GT）,1918年瑞士Glanzmann报道 BPC膜GPIIb-IIIa缺乏或质缺陷，BPC活化后不能结合BPC黏附蛋白 （Fg、vWF） BPC聚集功能障碍。 诊断： 血小板正常，散在分布；出血时间延长； 对各种聚集剂不聚集或严重减低；重症BPC中无Fg。 确诊：GPIIb-IIIa缺乏或减少（FCM） 治疗：输注BPC；DDAVP；rFVIIa,病例1、血小板无力症（GT）,患者，男，17岁，自幼反复鼻出血、牙龈出血，黑便2天。 父母近亲结婚，家族中无类似病史。 查体：重度贫血貌，皮肤可见陈旧淤班,余正常。 实验室检查：BPC 84X109，血小板形态正常 PT12.3”， KPTT35” ，vWF105%，BT 12， ADP诱导不聚集, Ristocetin诱导聚集正常， GPIIb/IIIa （CD41）13%，平均荧光强度1.32 ， 诊断：GT，IDA 治疗：输注血小板，Fe剂,血小板无力症膜糖蛋白分析荧光散点图,巨大血小板综合症 （Bernard-Soulier综合症，BSS）,BPC膜GPIb、GPIb 、GPIX基因缺陷，常染色体隐性遗传。 GPIb/IX/V复合物量或质缺陷, BPC不能与vWF结合,黏附功能减低。 实验室：出血时间延长、 BPC减少、 巨大BPC、 BPC寿命缩短、 除Ristocetin外,其他聚集剂反应正常 GPIb (聚丙烯酰胺凝胶电泳) 确诊：GPIb（ CD42b-CD42a） FCM 治疗：输注血小板,巨大血小板综合征糖蛋白分析,储存池病 (storage pool disease,SPD),BPC缺乏致密颗粒。 荧光法: 荧光染料盐酸阿地平标记BPC，显微镜观察。 FCM：直接测定致密颗粒,血小板自身抗体测定,包括： 针对人类组织相容性抗原的抗体：血小板表面相关抗体（PAIgG) 针对血小板膜糖蛋白抗体：GPIIb/IIIa,血小板特异性抗体与ITP,ITP：血小板特异性抗体介导血小板破坏增加 机制： (1)自身抗体包备在血小板上，抗体Fab端与巨噬细胞Fc受体(FcR) 结合，血小板被吞噬破坏； (2)抗原-抗体复合物激活补体C1q及各成分，C3b附着于血小板表面， 与巨噬细胞C3b受体结合，血小板被吞噬； (3)巨核细胞与血小板有相同抗原性，血小板抗体通过Fab端与巨核细胞 结合，巨核细胞成熟障碍。,血小板表面免疫球蛋白（PAIg）,抗自身BPC抗体引起免疫性血小板破坏 PAIg(BPC表面结合的IgG) FCM：阳性细胞百分率与荧光强度增加， 双峰或峰型异常（破坏与生成均增加） 敏感性 ELISA (单个BPC上PAIg) MAIPA（单抗特异性捕获血小板抗体试验） PAICA（ BPC相关IgG特异性试验） 特异性 MAIPA PAICA 血小板抗体免疫流式检测法（PAICA),FCM检测PAIg在诊断ITP中的评价,1、用于严重BPC减少者PAIgG检测； 2、特异性特异性结合抗体（MAIPA、PAICA） 特异性78-93%。敏感性49-66%； 可鉴别免疫与非免疫性BPC减少； 3、阴性不能排除；在诊断ITP中仅有参考价值。 目前国外（英国）已不作为ITP诊断标准。,特异性自身抗血小板膜糖蛋白抗体与ITP,GPIIb/IIIa为一种重要的靶抗原，抗体封闭GPIIb/IIIa， 血小板数量减少；血小板粘附、聚集功能抑制。 ITP患者血浆存在特异性抗GPIIb/IIIa抗体( CD61/CD41 ）， 抗GPIb、抗GPIX抗体。 利用PE标记的CD61抗体： 非ITP血小板减少组CD61表达率显著高于ITP组（P0.05）， CD61敏感性86.2%，特异性90%。（薛磊、朱微波）,网织血小板（RP)检测,骨髓最早释放到外周血中含mRNA的新生BPC，用荧光染料噻唑橘红或 金胺橙标记BPC RNA。反映骨髓血小板生成状态的指标。 传统方法：1、手工计数；2、自动计数 FCM临床应用： 1、ITP 2、干细胞移植：预测骨髓造血恢复，在血小板恢复前增高； 移植后10-26天,RP由2.91.713.66.4,达峰值后3天。 血小板45./L, RP逐渐降低。 3、化疗后骨髓抑制与恢复； 4、肝移植,网织血小板检测临床意义,ITP：BPC破坏外周血新生BPC含mRNA的BPC荧光强度、 百分率增加，且与BPC呈负相关： BPC，网织BPC-负相关 治疗有效： BPC，网织BPC。 治疗无效： BPC，网织BPC持续。 Aa： BPC，网织BPC,FCM检测在ITP诊断中的意义,1、PAIgG 50-60%阳性，可鉴别免疫与非免疫性BPC减少， 敏感性49-66%；特异性78-93%； 2、特异性抗GPIIb/IIIa抗体( CD61/CD41） 敏感性86.2%，特异性 90%； 3、网织BPC; BPC-负相关； 4、BPC微粒（PMPS）：BPC破坏产生 BPC PMPS。,FCM在血栓性疾病中的应用,1、血栓前（高凝）状态：BPC“活化”是参与血栓的前提，BPC活化指标： TXB2、GP（IIb/IIIa、Ib、V）、-TG、PF4、 GMP-140； 2、冠心病：P-sel；CD41/CD61；sGC均 不稳定心绞痛： P-sel，GPV AMI：P-sel，GPV ； 溶栓再通：1-6h， P-sel，GPV 溶栓未通： P-sel，GPV ； 3、脑缺血：活化标志物均； 4、糖尿病： P-sel ； BPC活化与血管病变有关 DM无血管病变：P-sel ；DM+血管病变：P-sel ,FCM分析血小板活化原理,血小板活化过程中生理、生化改变： 1、最早期反应：Ca+流 2、形态改变（圆盘伪足）：光散射改变 3、膜糖蛋白改变：GPIb/IX/V；GPIIb/IIIa+构型改变 4、颗粒膜蛋白表达：活化血小板标志物 释放反应a颗粒、溶酶体膜蛋白（CD62P、CD63） 5、暴露促凝表面： PS、PI暴露于膜表面 促进FV/Va、FVIII/VIIIa、FX/Xa、FIIa+Ca+ 参与凝血,血小板活化,a-granule,Weibel-Palade body,Endothelial cells,Platelets,Thrombin,P-Selectin 活化血小板的表面标志,Resting,Activated,P-Selectin,FCM血小板活化分析,血小板活化: 受体介导的静止血小板对各种刺激物的反应。 激活颗粒膜蛋白(CD62P)在质膜上表达活化标志物; GP构型改变与血浆中相应的受体蛋白结合 BPC聚集； BPC内分泌反应; BPC膜内、膜表面、血浆中GP成分改变 BPC活化的标志物。 利用各种活化依赖型单抗可反映BPC活化程度。,血小板活化标志物,-TG、PF4、TXB2、 血小板+白细胞(CD11c/CD18)-NC激活,介导炎症,血栓. 活化依赖的GPIIb/IIIa复合物（GPIIb/IIIa） P-选择素（P-sel、GMP-140，金标准） 糖盏蛋白（GC） 糖蛋白V（GPV） BPC微颗粒（PMP） 胞质内游离钙浓度: Fluo-3-Am 连续,动态,早期,血小板表面活化依赖的变化,P-选择素（P-selectin） （颗粒膜糖蛋白，GMP-140，D62p）,整合型- 跨膜区域，静止BPC 颗粒和活化的BPC质膜上； 静止BPC被凝血酶活化颗粒与质膜融合 BPC膜表达P-sel 活化BPC特异性标志物(金标准分子) 可溶性- 无跨膜区域(sP-selectin) ， BPC活化时释放到血浆中反映BPC活化的分子标志物。,a-granule,Weibel-Palade body,Endothelial cells,Platelets,Thrombin,P-Selectin Is a Surface Marker for Activated Platelets,Resting,Activated,P-Selectin,各组sP-selectin比较（XS，g /L） 组别 例数 P-选择素 control 50 15.625.89 UA 15 30.73.10.14* AMI 37 54.5611.87* *与正常对照组比较 P0.01,血小板糖盏蛋白 （glycocalicin，GC）,GPIb（ GPIb，）胞外部分 与vWF、凝血酶结合位点 GPIb对多种蛋白酶敏感，水解后释放 GC。 直接反映蛋白酶活化和BPC破坏的分子标志物, 判断BPC活化或黏附功能受损,有助于血栓研究.,sGC 正常值的建立及临床应用,表1. 各组血浆sGC水平比较（XS，g /L） 组别 例数 sGC control 50 824.50 225.11 UA 15 2073.34721.14* AMI 37 2415.60887.62* *与正常对照组比较 P0.01,血小板糖蛋白V（GPV）,与凝血酶受体GPIb-IX-V复合物中亚单位（GPIb-IX；GPV）。 GPV促进BPC表面GPIb-IX表达；增加与vWF结合；BPC活化负调控因子。 凝血酶活化BPC裂解GPV在膜外部分水解片段入循环sGPV 活化BPC新的分子标志物. 冠状动脉粥样硬化时血浆GPV增高。,表2. 各组sGPV水平比较（XS，g /L） 组别 例数 sGPV control 50 28.55.89 UA 15 118.4758.93* AMI 37 60.0143.35* *与正常对照组比较 P0.01,血小板微颗粒 （platelet microparticle，PMP）,血小板受刺激变形时成小泡或伪足,脱落入循环的聚合体（1967年,Wolf） 0.1-1.0ug: 表达特异性GP （GPIIb/IIIa、Ib、