精品根据浮力密度并应用密度依赖的细胞分离技术对海生细菌分类课件

根据浮力密度并应用密度依赖的细胞分离技术对海生细菌分类和初步鉴定,简介,本次研究的目的是测试一些天然海生细菌种群是否存在独特的的浮力密度，从而可以用密度依赖的细胞分离（DDCS）方法来分离。 我们首先浓缩一个天然细菌集合体来收集足够数量的细胞。我们用DDCS方法把它们分成三部分，每部分的群落结构由荧光原位杂交分开。 古生菌细胞趋向于出现在高浓度部分，反之那些噬细胞菌属-产黄菌属-拟杆菌属在低的浓度部分。,前言,浮力密度是一个单细胞水生生物体的基本物理特征，例如浮游植物和细菌。 对浮游植物来说，在考虑沉积速度的时候这个参数也必须被考虑进去。 但是对于海生细菌并不需要考虑浮力密度，因为海生细菌的浮力密度的意义并不明显。 浮力密度的不同能被用来分离微粒，DDCS方法已经被应用于实验室细菌培养。,前言,不同生理特征的细菌利用这个方法得到了成功分离，因为生理的变化可以改变细胞的组分以致于浮力密度。 因为天然海水的营养水平通常较低，并且恒定（大约1mg/L），所以没有或者很少有细胞处在符合实验室培养过程中的指数期的生理状态，而且在天然细菌群体中，生理状态的变化不像包含延迟期，对数期，稳定期的分批培养的细菌那么的大。,前言,DDCS的方法是很有说服力和应用前景的！,材料和方法,表层海水预过滤（3微米）超滤（2微米） 密度梯度离心分离不同密度的菌体 FISH 观察和计数,材料和方法样品的采集,我们用已经消毒过的塑料桶在一个名为Aburatsubo 小港口 (北纬3509.5, 东经13936.5; Sagami Bay, Japan) 的地方于2004年6月28日，2004年10月25日，2005年1月24日，2005年4月18日分别取得4升表层海水。,材料和方法预过滤,这些样品通过微孔聚碳酸酯过滤器(直径47毫米; 孔直径3.0微米; 型号 PC MB 111112; Whatman, Middlesex, United Kingdom)预过滤。,材料和方法超滤,然后，这些经过预过滤的样品经过另一种微孔聚碳酸酯过滤器(直径90毫米; 孔直径2.0微米; 型号 PC MB 111706; Whatman)进行超滤，超滤装置的型号为：(UHP-90K;Advantec, Tokyo, Japan)。 超滤的环境中充满了氮气，压力为1MPa。样品被浓缩至原浓度的133200倍。 经过不到4个小时的上述过程之后，这些样品被保存在零下4摄氏度的环境中。,材料和方法密度梯度离心,我们使用了一种名为Percoll (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) 的梯度工作溶液，这种溶液含有6163的Percoll，10的4M NaCl 溶液，10的10磷酸盐缓冲液（pH 7.4），以及1719的蒸馏水。,材料和方法密度梯度离心,接着我们取出毫升这种工作溶液，将毫升的我们的样品置于该工作溶液的表面，然后将这种混合液使用SW40 Ti 转头 (Beckman, CA) in a Beckman Optima XL-90 离心机在50,512 g and 4摄氏度下超速离心分钟 经过超速离心后, 通过使用Piston 梯度分馏器 (Biocomp, Fredericton, Canada)这些样品被分成上，中，下三层。,材料和方法细菌数量的计数,每层分别用高压蒸汽灭菌过的，而且用微米孔径的过滤器过滤过的人造海水稀释，然后被终浓度为的多聚甲醛固定。 在用（4,6-二脒基-2-苯基吲哚）染色后，细胞的数量通过荧光显微镜(BH-2; Olympus, Tokyo, Japan) 计数出来。,材料和方法细菌种类的鉴定,每个被分层的样品被Isopore聚碳酸酯过滤器(直径25毫米; 孔径 0.2 微米; type GTTP 02500; Millipore, Eschborn, Germany) 过滤，过滤条件为真空。 这些过滤器和样品在过滤操作之前都置于零下摄氏度的环境中。,材料和方法FISH,每个过滤器被切成了个片断，然后放置在载玻片上，并用封口膜(American National Can, Chicago, IL)覆盖，而且用含有微升杂交缓冲液（表）和微升的含有纳克每微升的上述寡核苷酸片断的探针的共微升的混合溶液覆盖。,材料和方法FISH,在摄氏度的温箱中恒温培养了分钟后，上述过滤器被转入到一个含有摄氏度洗脱液的小瓶中，并在摄氏度下培养分钟。接着将这些过滤器取出，放置于Toyo滤纸(Advantec)上晾干，然后放置在封口膜上，并用微升的溶液（经过0.2微米孔径过滤的以蒸馏水溶解的终浓度为1微克每毫升）浸泡，注意这个过程是在室温和黑暗条件下进行的。,材料和方法FISH,然后这些过滤器被轻轻的用毫升的微米过滤过的蒸馏水清洗，接着在Toyo滤纸上晾干，在载玻片上用Citifluor AF1 (Citifluor Ltd., Canterbury, United Kingdom) 制成标本装片。 在杂交之后，过滤器片断上的细菌可以通过荧光显微镜(BH-2; Olympus)和过滤器接收机计数出来。 对于每个样品和探针，至少菌落和多于个细胞被数出来。所有的数量可以通过减去NON338 探针这一阴性对照来校正。,实验结果,细胞浓缩效率：由浓缩前后海水中细胞个数的百分数比率表示。 DAPI阳性细胞：可以被DAPI染色，从而能通过荧光显微镜进行计数的细胞。 “总细菌”：在实验中所有能被DAPI染色的细菌。 实验并没有把注意力放在细菌形态大小的不同上。,每组样品中，由不同染料或探针所测得的细胞浓缩效率,实验结果,实验结果,由上表可以看到： DAPI阳性细胞的细胞浓缩效率分布由88至96。 若从不同的染料或特定探针效果来看浓缩效率则从66（2004年10月25日， CF319a ）分布到100（2005年1月24，GAM42a）。（平均值91，标准偏差9.2，变异系数10，样本总体N24）在浓缩过程中没有改变相关种群相对的数量关系。,实验结果,每一样品根据浮力密度被分成上、中、下三部分： 上1.074 g/ cm3 。 对于四个样品，分馏前的三部分的“总细菌”占总体细菌的49到71（平均61，标准偏差9.1，变异系数15）。,实验结果,用染剂或探针所显示的各部分的比例,实验结果,由上图左部分的DAPI可以做出下表：,实验结果,上图右部分的探针测试： 实验收集了四个不同季节的样品，在所有的使用探针的样品中的变异系数为0.2413 。 我们发现在相关的细菌种群中存在一种趋势：属于噬细胞菌属-产黄菌属-拟杆菌属的更集中于上层部分低浓度部分，而古生菌细胞趋向于出现在下层部分即高浓度部分。,Discussion,从天然海水中富集的的细胞用DDCS的方法被分成三部分，每部分的群落结构可通过荧光原位杂交（FISH）来证实。古生菌的细胞倾向于出现在高密度部分，CFB细胞出现在低密度的部分。这个结果显示一些分类学群体有着独特的浮力密度。,细胞富集 :,对于DDCS方法，一毫升样品加在工作溶液的表面。对于有着不同类探针的FISH，为了得到足够数量的细胞，很必要在实验步骤前富集细胞。在预先的调查之后，我们决定得到一个密度大约为每毫升108个细胞的悬浮液，这需要100-200倍浓缩的天然海水样品。目前方法的富集效率大约为90%，这种效率适合于切向流系统培养的埃希氏大肠杆菌。我们发现不同的探针特异的组之间的富集效率差别很小，说明在富集过程中没有差别。在这项研究里，用DDCS分离样本后再应用荧光原位杂交法，是因为在培养依赖的技术中，这种方法能提供最可信的数据资料。如果有另一种需要较少细胞的方法被应用，细胞富集的程序被可以省去。,DDCS应用于自然海生细菌群落：,在以前的研究中，DDCS被专门应用到在实验条件下培养的细菌细胞中。依靠INT将DDCS应用于自然细菌群体是专门为了增加有益活生菌的密度；因此不是依靠自然群落的浮力密度的差别。当应用于自然的聚集体时，用DDCS分离细胞应该仅仅依靠它们的浮力密度，而不是其他的因素如细胞大小和凝集。如果在目前的超速离心法的条件下，沉降平衡没有被建立，这些因素会明显影响结果。假设细胞直径是0.3m ,浮力密度是1.087g/cm3,在目前的超速离心状态下细胞会移动163mm。因为密度为1.087g/ cm3的浮力标记珠位于距测试管表面65mm处，沉降平衡应该在超速离心式间段内建立。细胞的形状也不会造成什么影响，因为轴比为20的长椭球在我们的超速离心状态下会移动82mm。因此，细胞大小，形态和聚集状态等因素很难影响到当前的结果。显微观察也支持这个观点。,海生古生菌和真细菌的浮力密度：,应用DDCS，我们发现属于噬细胞菌属-产黄菌属-拟杆菌属（CFB）的自由生长细胞的浮力密度（分散在顶部）比自由生长的古生菌细胞的浮力密度低（底部）。这个发现与这些群落在自然海水中的分布相符。由于浮游植物，CFB细菌倾向于生活在表面，而古生菌占据了一半以上深海细菌，尤其是在1000m以下。虽然古生菌细胞的细胞膜普遍由阿克醇和卡克醇组成，而真细菌的细胞膜由油脂构成，究竟哪种细胞特征解释了浮力密度的不同还不清楚。因此生物化学研究也许能解释影响浮力密度的因素。在这项研究中我们无法找到其它亲缘群体的浮力密度变化趋势，可能是由于它们是具有生理差别的细胞的混合体，也许是由于每一个群落都包含了具有广泛密度特征的亚群组成。,细菌沉降速率计算：,因为这个工作提供了第一手的海生细菌群落浮力密度的数据资料，我们同时用Stoke定律估计了它们的沉降速率。对于海生细菌和海水我们做了如下假设：细胞是直径为0.3 m的球体；低，中，高密度细菌的浮力密度分别是1.047，1.067，1.087，海水的密度是1.027 g/cm3,这时的海水温度是5。在这个假设的基础上，低，中，高密度的细菌的沉降速率分别是10，20和30m/h-1,这些数值在20时增长1.5倍。 这个沉降速率很小，海生细菌实际上不能在拥有与我们计算中的假设所不同的物理化学因素和密度的水团或水流中移动。然而，大约1030m h-1的沉降速率说明细胞能被重力作用影响，这正解释了它们的垂直运动。近期研究结果显示微尺度为（2，16，17，18）的细胞存在异向分布。依赖于浮力密度的细菌沉降速率可能导致了这种分布机制