6代谢组学技术及其在中药研究中的应用.ppt

代谢组学技术及其在 中药研究中的应用,Wuhan university,武汉大学 周本宏,代谢组学 概 念,是生物体或细胞在外源性物质或病理生理刺激和遗传因素改变的条件下，内源性代谢物会发生变化，利用现代分析方法对体液、细胞或组织中的所有低分子量内源性代谢物组（endogenousmetabolites）进行定性、定量分析，定量检测其代谢变化，通过测定整个机体的系统代谢图谱来探讨基因功能调控机制的学科,Wuhan university,吸收,分布,代谢,排泄,内源性代谢物改变,药物,外源性代谢产物,内源性代谢产物是基因表达的终产物，代谢组学所关注的是相对分子质量为1,000以下的小分子物质,Wuhan university,病理生理的变化,历史沿革,英国帝国理工大学J.K Nicholson教授的研究小组利用核磁共振(NMR)技术分析大鼠的尿液, 并于1999年J.K Nicholson教授等3名科研人员共同发表了一篇“代谢组学”研究论文，一个新的学科从此诞生，Nicholson教授也由于其在代谢组学发展中的开拓性的贡献，而被誉为“国际代谢组学之父”,Wuhan university,历史沿革,是继基因组学、转录物组学、蛋白质组学之后的一门新型学科，是系统生物学的重要组成部分 系统生物学（system biology）研究的四个层次：,Wuhan university,系 统 生 物 学,基因与蛋白质的表达紧密相连,代谢物则更多地反映了细胞所处的环境。正如Billy David所言:“基因组学和蛋白质组学告诉你可能发生什么,而代谢组学则告诉你已经发生了什么”,历史沿革,Wuhan university,历史沿革,1999年Nicholson首次提出了以NMR分析为主的代谢组学研究模式并联合国际六大医药公司（Bristol-Meyers-Squibb,Eli lilly,Hoffmann-laRoche,NovoNordisk, Pfizer,Pharmacia）英国帝国学院（Imperial College,London）面对风险的挑战，于2001年组织并公布了一个研究计划COMET（Consortium for Metabonomic Toxicology）,应用代谢物组学评价药物毒性，进行候选药物的临床前毒性筛选，进而对广泛模型化合物评价和安全性预测，以缩短药物开发的时间，减少损失.3年中对大鼠和小鼠的尿液用NMR分析研究了150个肝肾毒性模型,Wuhan university,历史沿革,自2002年第一届国际植物代谢组学大会在荷兰瓦赫宁根召开以来，植物代谢组学分析技术和方法发展迅速已开始应用于植物科学研究、生物安全性评价等多个领域，在基因功能研究、代谢途径及代谢网络调控机理的解析等方面发挥重要作用 我国植物代谢组学的研究于2005年前后开始起步，目前已形成较好的发展趋势,Wuhan university,代谢组学研究的优势,与研究蛋白组或基因组相比，研究代谢组具有许多优势： (1)生物体的小分子代谢产物所构成的代谢组要比转录物组蛋白组简单得多(例如酿酒酵母有6 000多个基因，但代谢物仅有600个)，那么分析代谢组就降低了样本的复杂性； (2)对多数小分子内源性代谢产物的作用及其所在代谢通路代谢调控已有相当的认识，而目前对基因功能与调控的认识仍相当有限,Wuhan university,代谢组学研究的优势,(3)代谢组是基因功能活动的终点。代谢控制理论和实验证明在一个生化反应中，虽然酶的浓度和代谢通量不会发生重大变化，但是代谢物的浓度会发生很大变化，因此针对代谢变化重大的代谢物进行分析更加直观，也更加敏感 代谢组是基因表达的下游产物，所以它更能正确地反映细胞的功能水平，与蛋白组或基因组相比，代谢组具有终点放大的特征。研究表明代谢通量不仅受基因表达控制，而且还受环境的调节，因此，测量下游产物代谢物较为合适从这一角度分析，代谢组包含的信息量要大于基因组、蛋白组学,Wuhan university,代谢组学研究的优势,(4)代谢组变化揭示的是系列关联生物标记物(biomarker)的综合差异，要比传统依赖单一标志物的诊断方法具有更高的准确性，而且其最小限度的侵入性以及时空动态性，是基因组和蛋白组学研究所无法比拟的。 (5)代谢物谱在不同生物样本中基本上都是一样的，再加上其检测技术的多样性，代谢组学的研究具有较好的便利性,Wuhan university,代谢组学研究的特点,代谢组学作为一门新兴学科，概括起来具有以下特点: 对机体损伤小，其检测的体液主要是尿液与血液； 信息量大，代谢组学能够提供整个机体功能统一性信息； 检测更容易，基因和蛋白质表达的有效的微量变化会在代谢物上得到放大； 无需特征化的数据库； 检测物种类少，代谢物的种类数远远小于基因和蛋白数目 代谢物产物具有通用性； 能够反映生理病理状态,Wuhan university,研究方法,代谢组学研究步骤包括： 样品采集与制备； 样品分析与鉴定； 数据处理与分析； 生物标志物（Markers）分析,Wuhan university,Wuhan university,研究方法,样品采集与制备： 采集后的样品需首先进行预处理，而且整个预处理过程应尽可能保留和体现样品中完整的代谢物组分信息。 组织样品取样后，由于酶活性和氧化过程的继续，会引起代谢物的生成和改变，故样品需即时用液氮冷冻，低温（-80）贮存。血和尿样也应在-80保存，尿样中还要加叠氮化钠抑菌,Wuhan university,研究方法,尿样或稀释的尿样可直接进样，优点是在样品制备时，代谢物没有损伤，高通量。缺点是直接用ESI/MS分析时，盐类有抑制作用（代谢物之间也会相互抑制），在ESI过程中生成加合物，不挥发物的积累会降低仪器性能。 血液和尿样常用甲醇、乙腈或混合溶剂沉淀蛋白，离心后取上清液进行分析或除去溶剂后，用LC流动相溶解后分析 溶剂萃取应用得最早，冷冻的组织样品常用溶剂萃取，样品需要在冷冻情况下粉碎，选用极性与非极性溶剂的结合如甲醇/氯仿，可形成双相，分别对水溶性及脂溶性相进行分析,Wuhan university,研究方法,样品分析与鉴定： 近年来，各种分离分析手段如色谱、质谱、核磁共振（NMR）、毛细管电泳、红外光谱等及其联用技术都应用于代谢组学的研究中，其中最常用的分析技术是NMR技术和GC-MS、LC-MS等各种联用技术。NMR方法具有无损伤性，无偏向性等特点，但其灵敏度较低；GC-MS方法具有较高的分辨率和检测灵敏度，并且有标准谱图库可以对照，但对于挥发性较低的代谢产物需要进行衍生化处理，且预处理过程相对繁琐；LC-MS方法具有良好的客观性、选择性和分辨率，避免了GC-MS中衍生化等繁琐的预处理过程,Wuhan university,研究方法,数据处理与分析： 代谢组学是通过数据引导的一门学科，数据处理与分析技术在代谢组学研究中具有至关重要的作用。这就要求充分运用化学计量学理论和多元统计分析新方法对采集的多维海量原始数据进行压缩降维和归类以实现从大量的原始数据中挖掘出隐含其中的有效信息，最终实现代谢模式的正确识别,Wuhan university,研究方法,数据处理与分析 模式识别技术主要分为2大类：非监督（un-supervised）学习方法和有监督（supervised）学习方法。非监督学习方法主要适用于在不具备任何相关背景知识的情况下，进行生物样本的类别判断和生物标志物识别。常用的方法有主成分分析法（PCA）、非线性映射（NLM）、簇类分析（HCA）等。其中以PCA方法最为常用，PCA的原理是将高维数据降维，并将数据投影变换到变异最大的主轴上，从而提取出数据集的特征，它对所用的数据进行无歧视的分析，无论是内源性物质，还是外源性物质的代谢产物峰都能进行分析，是目前代谢组学数据处理的主要方法,Wuhan university,研究方法,数据处理与分析 有监督学习方法用于建立类别间的数学模型，使各类样品间达到最大的分离，并利用建立的多参数模型对未知的样本进行预测。常用的方法有偏最小二乘法（PLS）、软独立建模分类法（SIMCA）、偏最小二乘法显著性分析（PLS-DA）和人工神经网络（ANN）技术等其中最常用的也是最基础的分析方法是PLS,Wuhan university,代谢组学各分析流程技术,Wuhan university,代组学相关数据库,Wuhan university,在中医药研究中的应用,评价药物的毒性 药物的安全性研究 中药药效物质基础和作用机制研究 中医证候模型的研究 中药质量控制研究 中药活性成分代谢产物研究 中药及其复方的多靶点药效作用机制研究等,Wuhan university,基于代谢组学的中药整体药效研究,代谢组是生物体整体功能状态的“生化表型”，因而对于表征中药“多组份、多靶点弱效应协同、有机整合整体效应”具有突出优势,Wuhan university,不足之处,分析手段有限，尚无任何一个分析技术能够同时对所有代谢物进行分析。尚无有效数据分析手段将所得到的全部信息进行分析和解释 数据库很不完善 缺乏代谢产物数据的标准值 另外样品之间的差异、仪器动力学范围的局限和分析误差的存在也给代谢组学分析带来巨大的挑战。因此在取样方法,新型分析仪器和分析技术等方面，都需要有很多进一步深入的工作,Wuhan university,雄黄、朱砂 国家标准中收载含朱砂、雄黄的中成药占收载的全部的中成方制剂的6.34% 应用广泛，历史悠久 有效和有毒的双重性 安全性倍受关注,Wuhan university,Wei等采用代谢组学的方法对雄黄、朱砂的毒性进行了研究： 雄性Wistar大鼠灌胃给药； 采集尿液； 1H NMR对代谢物进行分析； 生物标志物的分析；,Lai Wei, Peiqiu Liao,et al Toxicology and Applied Pharmacology 234 (2009) 314325,结果表明: 尿液中，三羧酸循环中间产物柠檬酸盐(citrate)、琥珀酸盐(succinate)、2酮戊二酸盐(2-ketoglutarate)显著增加；乙酸乙酯、牛磺酸(taurine)、丙酮显著增加，并伴随着二甲基甘氨酸(dimethylglycine)、丙酮酸(pylllvate)和肠道菌产物苯乙尿酸(phenylacetylglycine)、马尿酸盐(hippurate)等内源性代谢产物的减少，且这些内源性代谢产物的变化呈现时间和剂量依赖性。 二甲基甘氨酸为肾乳头的毒性标志物，丙酮为肾脏皮层S3段的毒性标志物。牛磺酸为肝脏受损的指标上述代谢产物分析表明，对肝肾具有一定的毒性,Schematic representation of the energy metabolic network,. Schematic representation of the degradation pathway of choline,朱砂主要成分为HgS，雄黄主要成分为As2S2 朱砂、雄黄在人体内的毒性程度与以下因素相关： （1）在体内产生的可溶性砷、汞量 （2）上述可溶性的砷、汞在体内的存在价态,Wuhan university,砷的不同价态及其毒性： 砷化氢（AsH3）亚砷酸(As)和砷酸(As) 甲基砷酸()和二甲基砷酸() 胂甜菜碱()和胂胆碱() 基本无毒 汞的不同价态及其毒性 ： 甲基汞乙基汞Hg2+Hg,Wuhan university,有研究表明，含朱砂、雄黄的中药制剂经口服后，其所含的砷或汞基本不被人体吸收。实验表明：在粪便中所检测到的总砷、总汞，分别占给药量的99和98.5 因此仅以砷、汞元素的总量作为判断其是否安全是不科学的 研究雄黄中砷、朱砂中汞在体内可溶性部分的含量及其可溶性的砷、汞在体内的存在价态，合理评价该类药物，保证含朱砂、雄黄中成药的安全性和有效性,Wuhan university,复方黄黛片的主要成分,四硫化四砷雄黄 靛玉红青黛 丹参酮II-A -丹参,四硫化四砷 Tetraarsenic tetrasulfide,靛玉红 Indirubin,丹参酮II-A,治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)的现代中药配方制剂,本课题组关于代谢组学的实验研究,基于代谢组学的天麻川芎 药对配伍研究,Wuhan university,研究背景-天麻 川芎,Wuhan university,成分：酚类，甾醇类、有机 酸、氨基酸类 药理作用：镇静、镇痛、抗惊厥,成分：挥发油、生物碱、酚性物质、苯酞内酯 药理作用：镇静、镇痛 、抗凝血,天麻,川芎,研究背景-天麻川芎 药对,配伍依据： 疾病特点 药性及药效,作用： 减少药物毒性 增强药效,药对,偏头痛多属于内伤类头痛，常和“风”有关 天麻川芎药对恰合偏头痛的病机,天麻能祛风湿以 止痛、平肝熄风以止痉,川芎具有活血、行气、 祛风、止痛的功效,Wuhan university,研究背景-天麻川芎 药对,药对是古代医家应用在中药复方中的一种特殊形式，是中药复方的最小单位，其配伍的规律及作用机制是现代中药研究的热点之一。 天麻和川芎常作为药对使用，是历代医家用于治疗偏头痛、眩晕的经典药对组合 ，不过不同时期各大医家对其配伍比例却不尽相同，用法也各异在本草纲目等古代本草书籍中，记载的天麻川芎用量之比最常见的比例为1:4和4:1 ，其中天麻川芎用量之比1:4最为常见,Wuhan university,研究内容,Wuhan university,药材分组： 天麻组 川芎组 天麻川芎A组（天麻：川芎=1:4） 天麻川芎B组（天麻：川芎=4:1） 提取方法： 10倍量70%乙醇 提取时间1h 提取3次,一、天麻川芎不同配伍比例对有效成分提取的影响,-天麻川芎不同配伍比例对有效成分提取的影响,Wuhan university,流动相：甲醇-水( 50:50) 检测波长：280nm； 柱温：25； 流速：0.8mL.min-1,川芎嗪的含量测定,-天麻川芎不同配伍比例对有效成分提取的影响,Wuhan university,川芎嗪含量测定结果,-天麻川芎不同配伍比例对有效成分提取的影响,Wuhan university,流动相:水:甲醇:冰乙酸(95：5：1) 流速: 0. 8mLmin-1 检测波长: 270nm 柱温：25,天麻素含量测定,-天麻川芎不同配伍比例对有效成分提取的影响,Wuhan university,天麻素含量测定结果,结论,天麻川芎配伍后有利于其有效成分的溶出 其中川芎嗪含量的提高比天麻素明显,药对配伍比例会影响到有效成分的溶出率其中天麻川芎用量之比1:4时其有效成分的溶出率相对较高,Wuhan university,二、天麻川芎药对对大鼠尿液内源性代谢时间轨迹分析,Wuhan university,正常对照组 川芎组 天麻组 天麻川芎 A组 天麻川芎B组,正常对照组： 给予生理盐水 其余各组： 给予药材提取液,代谢笼采集大鼠尿液 甲醇去蛋白，离心,1.动物分组,2.灌胃给药,3.尿样采集,Wuhan university,流动相：乙腈(A)、0.1甲酸(B)，流速：0.4 mLmin-1， 进样量：3L，柱温：35，梯度洗脱条件如下表：,毛细管电压为4000V；雾化器压力为40 psi； 干燥气流速：10Lmin-1，干燥气温度：350,4. LC-MS数据采集,Wuhan university,将LC-MS原始数据进行转化后 导入SIMCA-P软件、MATLAB软件进行主成分分析,5. 数据分析,主成分分析法： 将许多相关的变量转为少数几个彼此独立的综合指标的统计方法 它让多个变量的复杂关系变得简单，有利于获取其中最有效的数据,在进行主成分分析后，可在80以上的精度下，用2-3个新 变量取代原来的n个变量,单击此处添加标题,由原始变量的观测数据计算前 k个主成分的得分，将其作为 主成分F1，F2，Fk的观 测值，来建立Y 与主成分 回归方程,生成得分图,生成载荷图,分类信息,寻找生物标志物,Wuhan university,单击此处添加标题,通过得分矩阵可得到得分图 (Scores Plot) 在得分图上，样本得分点之间的距离越大表明样本之间的差异越大，大鼠尿液的代谢物状态差异越大 C0，C1，C2，C3，C4分别表示正常对照组大鼠在第1，8，15, 22, 29天收集的尿液样本；A0，A1，A2，A3, A4分别表示给药组大鼠在第1，8，15, 22, 29天收集的尿液样本,Wuhan university,实验结果,Wuhan university,天麻组SIMCA-P平面得分图,天麻组MATLAB平面得分图,川芎组SIMCA-P平面得分图,川芎组MATLAB平面得分图,Wuhan university,天麻川芎A组SIMCA-P平面得分图,天麻川芎A组MATLAB平面得分图,天麻川芎B组MATLAB平面得分图,天麻川芎B组SIMCA-P平面得分图,小 结,给药时间为29天时， 各给药组大鼠内源性代谢整体变化最大,两种软件主成分分析得到的结果是一致的,SIMCA-P软件比MATLAB软件更适合 在医药学研究中使用,Wuhan university,三、天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢影响,Wuhan university,正常对照组、模型组、 天麻组、川芎组 天麻川芎A组、天麻川芎B组 阳性对照组 正常对照组、模型组给予生理盐水 阳性对组给予阳性药物 其余各组分别给予相应的药材提取液 除了正常对照组，各组大鼠均在给药后于 右肩部注射硝酸甘油注射剂（10mg.kg-1） 尿液收集及数据采集方法同前,动物分组,动物给药,动物造模,尿液、数据采集,天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢影响,偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA） 与PCA分析相似，都是为了提取出主成分，简化数据 与主成分的不同点是加入哑变量（分组信息）来引导分类,天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢的影响,Wuhan university,基于代谢组学的硝酸甘油致偏头痛大鼠模型验证分析,正常对照组与偏头痛模型的PLS-DA平面得分图与三维得分图,正常对照组与偏头痛模型的PCA平面得分图与三维得分图,天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢的影响,Wuhan university,不同配伍比例的天麻川芎药对对偏头痛大鼠尿液内源性物质的影响,1：正常对照组；2：阳性对照组；3：天麻川芎A组； 4：天麻川芎B组；5：川芎组；:6：天麻组；:7：模型组,天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢的影响,Wuhan university,1：正常对照组；2：阳性对照组；3：天麻川芎A组； 4：天麻川芎B组；5：川芎组；:6：天麻组；:7：模型组,天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢的影响,Wuhan university,天麻川芎A组对偏头痛大鼠尿液内源性物质代谢途径的影响,正常对照组（蓝），阳性对照组（绿），天麻川芎A组（橙）与模型组（红） PCA平面得分图与三维得分图,天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢的影响,Wuhan university,正常对照组，阳性对照组，天麻川芎A组与模型组PCA载荷图,5.生物标志物的寻找与鉴定 载荷图中距离原点越远的点，表示其代表的变量对分类的 贡献越大，越有可能成为潜在的生物标志物,天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢的影响,Wuhan university,正常对照组，阳性对照组，天麻川芎A组与模型组PLS-DA载荷图,天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢的影响,Wuhan university,正常对照组，阳性对照组，天麻川芎A组与模型组PLS-DA的VIP柱状图,VIP值表,VIP值可评价PLS-DA模型中变量的重要程度， VIP值越大，显示变量对模型越是重要 选取VIP值大于1的变量作为候选生物标志物 随后根据质谱信息及数据库等方法寻找生物标志物,天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢的影响,Wuhan university,硫辛酰胺质谱图,该化合物的分子量为205.0，根据氮元素规则可知，该化合物应含有奇数个氮原子 通过质谱分析其主要碎片离子为189.1,161.0,推测可能是分子离子峰先失去一个