2010版药典微生物与无菌课件

2010年版药典附录无菌检查和微生物 限度检查方法增修定内容,一：新增微生物限度检查法指导原则 二：2010年版无菌检查法增修订内容 三：微生物限度检查增修定内容 四：新增微生物限度检查法指导原则 一、抑菌剂效力检查法指导原则 二、药品微生物检验替代方法验证指导原则 三、微生物限度检查法应用指导原则 四、药品微生物实验室规范指导原则,一：药品微生物实验室规范指导原则,目的 该指导原则用于指导药品微生物检验实验室的质量控制。 药品微生物的检验的对象具特殊性； 活的生物、 分布不均匀、重现性差 必须使用经验证的检测方法并严格按照药品微生物实验室规范要求进行试验,影响试验结果的因素1人员2设施与环境 3检验的标准与方法4设备 5测量的溯源性抽样7样品的处理 8检验结果准确性的控制9检验报告 药品微生物实验室规范包括以下几个方面 人员、培养基、菌种、实验室的布局和运行、设备、文件、实验记录、结果的判断等,人的要求,1：人是质量控制与管理的主体 2：2010年版无菌检查法增加了对进行无菌检查人员的要求：必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。 3;考试上岗问题;检验人员经过考试（理论与操作考试），经过技术负责人批准取得上岗证方可从事药品微生物学检验,培训内容,1上岗前指导性培训：生物安全操作知识和消毒知识，卫生要求，洁净区的使用，保洁与检测等。 2上岗培训：各种有关微生物的操作技术（无菌，微生物限度，效价），与各种检验标准知识，设施，设备的使用 3继续教育提高培训：新知识，新仪器新技术的使用，国际国内先进的微生物学检验专业知识。 4质量观念的培训：实验室的质量目标，相关计量知识的学习,培养基,培养基是微生物试验的基础，直接影 响微生物试验结果。适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制试验是提供优质培养基的保证。 该指导原则对培养基的制备、储存、灭菌及质量控制进行了指导。,培养基必须具备五个条件,: 1含有细菌生长所需的物质：如：水分、养分（氮源、碳源、矿物质） 2适宜的酸碱性：多数为pH7.2-7.6，有的为pH5.6-6.8（最常用的溶剂为纯化水特殊情况下用去离子水或者蒸馏水） 3不含抑制细菌生长的物质 4 均质透明：便于观察细菌生长性状和引起培养基的变化 5严格灭菌，保证无菌。（按生产者提供或者使用者验证的参数灭菌）,菌 种,实验室菌种的处理和保藏的程序应标准化， 使尽可能减少菌种污染和生长特性的改变。 按统一操作程序制备的菌株是微生物试验结果一致性的重要保证。,该指导原则对菌种的来源、菌种保藏、 菌种的传代和使用、菌种的管理进行了详细的说明和指导。,菌种代号的意义,国内药品微生物检验所用的菌种代号是 CMCC（ F） 或 CMCC（ B） CMCC 中国医学菌种保藏中心 B 代表细菌,F 代表真菌 。 大肠杆菌 CMCC (B) 44102 乙型副伤寒沙门杆菌 CMCC (B) 50094 生孢梭菌 CMCC(B)64941 白色念珠菌 CMCC(F)98001,、菌种保藏的原则,菌种保藏的原理 微生物的菌种生理、生化特性，在人工创造的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度，使细胞基本处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但又不至于死亡，以减低菌种的变异率。低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都有抑制微生物的代谢作用。,、菌种的传代和使用,工作菌种的传代次数应严格控制，不得超过5代防止过度的传代造成菌种变异,工作菌株不可代替标准菌株. 任何亚培养的形式均被认为是转种或传代一次。实验室应对工作菌株的特性和纯度进行确认。,标准菌株,一般是从菌种保藏中心或专业实验室购买得到的，用符号S表示。一般可保存5年。 按菌种保藏中心的要求进行恢复培养。中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)建议的方法如下： 安瓿管开封：用浸过70酒精的脱脂棉擦净安瓿管，用火焰将安瓿管顶端加热，滴无菌水至加热的安瓿管顶端使玻璃开裂，用锉刀或镊子敲下已开裂的安瓿管的顶端。 菌株恢复培养：用无菌吸管，吸取0.3-0.4ml适宜的液体培养基（如营养肉汤），滴入安瓿管内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状，取约0.2ml菌体悬浮液，移植于指定的琼脂斜面/平板培养基上，剩余的菌液，注入指定的液体培养基内（3-4ml），然后在建议的温度下（一般培养温度32.52.5，1824h）培养。,标准储备菌株,标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株.冷冻菌株一旦解冻转种制备工作菌株后,不得重新冷冻或再次使用。 采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡覆盖保藏法，用于菌种的传代，。甘油冷冻管保藏法一般可保存2年；,甘油冷冻管保存法,甘油冷冻管保存法适用于保存传代用菌种，一般可保存2年。 将待保存用菌种接种至平板或琼脂斜面，经372448h培养后，用无菌接种环轻轻刮 取菌苔，移至预先装有无菌蒸馏水的试管中，调整菌液浓度，使其等同于1单位麦氏比浊管。 向已制备好的菌悬液中加入等体积，浓度为20%的无菌甘油，得到10%甘油菌悬液。 轻轻振摇，使10%甘油菌悬液充分混合，分装于无菌小试管中，在-30条件下贮存。,工作菌种,： 工作菌株不可代替标准菌株，标准菌株的商业衍生物仅可用作工作菌株 保存于半固体内或琼脂斜面培养基中，作为工作用菌种，用符号W表示。一般可保存12个月。严格控制传代次数，工作菌种不超过五代， 冻干菌种营养肉汤半固体琼脂或甘油水100支冰箱保存 （原代）（一代）（二代）,菌种的管理,严格的程序化管理 实验室必须建立菌种保存和使用文件的程序管理制度,菌种的销毁,1方法：菌种销毁采用高压蒸汽灭菌：121，20分钟。 2需及时销毁处理菌种：发生污染或变异的菌种；超过保存期限的菌种；使用后的菌种。,实验室的布局和运行,实验室布局设计的基本原则 具有检测所需的适宜、充分的设施条件。 合理的布局与设计，具有独立的实验室、 辅助区域各区域应有明确标识。 建立控制程序和标准操作规程。,建立合理的控制程序和标准操作规范,对进出洁净区域的人和物建立控制程序和标准操作规程。 消毒剂的配制应按标准操作规程配制，对所用的消毒剂种类应定期更换，使用的消毒剂应无菌。,建立检样品传递、储存、处置和识别管理程序。 建立带菌培养物溢出的意外事件制定处理规程。 建立合理的取样控制程序和标准操作规范。,设 备 实验室应配备与检验能力和工作量相适应的仪器设备，其类型、测量范围和准确度等级应满足检验所采用标准的要求，设备的安装和布局应便于操作，易于维护、清洁和校准。使用的消毒剂应无菌。 建立相应的操作和维护和保养的标准操作规程。,文件,文件应当充分表明试验是在实验室里按可控的检查法进行的，一般包括以下方面：质量管理文件、程序文件、技术操作文件。,实验记录的保存,实验结果可靠性的依赖于试验严格按照标准操作规程进行，包括正确的试验操作、实验记录、(所有关键的实验细节)，以便确认数据的完整性。,结果的判断,由于微生物试验的特殊性，在实验结果分析时，应从各个可能的方面去考虑，不但要假设被污染，而且要考虑微生物在原料、辅料或试验环境中存活的可能性。此外，还应考虑微生物生长特性。,如果依据分析调查结果发现试验有错误而判实验结果无效，那么这种情况必须记录。实验室也必须认可复试程序，如果需要，可按相关规定重新抽样，但抽样方法不能影响不符合规定结果的分析调查。,二：2010年版无菌检查法增修订内容,一、进一步确定了无菌检查法的定义： 无菌检查法系用于检查要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。 二、进一步明确了无菌检查保障 1、检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染 ，但采用的措施不得影响微生物的生长。 2 、无菌检查要进行环境检测增加了日常检验还需进行环境检测。 2、无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。,三、培养基增修订内容,删去硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基的使用范围(用于培养好氧菌、厌氧菌及用于培养真菌) 删去选择性培养基使用的表面活性剂种类对氨基苯甲酸、聚山梨酯-80等。 理由 经验证试验选择适宜的中和剂、灭活剂和表面活性剂,培养基适用性检查增修订内容 3、培养基灵敏度试验 删除 菌悬液制备中黑曲霉菌悬液的制备 “（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）” 修改为“用适宜的方法吸出孢子悬液”。 增加在稀释液0.9%无菌氯化钠溶液中加入0.05v/v）聚山梨酯80。,四、试验稀释液、冲洗液增修订为 增加根据供试品的特性，可选用其他经验证过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液。 试验中使用的中和剂、灭活剂和表面活性剂除证明其有效性外还应证明对污染的微生物无影响修改为无毒性。,五、方法验证试验增修订内容,试验菌株 删除铜绿假单胞菌增加大肠埃希菌及大肠埃希菌菌液的制备(同金黄色葡萄球菌)。 薄膜过滤法 供试品用量 将规定量供试品 按薄膜过滤法过滤 修改为取每种培养基规定接种的供试品总量。,六、供试品的无菌检查增修订内容,检验量 直接接种法除另有规定外，每份培养基接种的供试品量按表2、表3规定删除采用直接接种法时的规定。 阴性对照 无菌试验中若使用表面活性剂等应证明其有效性且对微生物生长无影响修改为无毒性。,薄膜过滤法 增加了抗生素供试品滤膜选择的指导 应选择低吸附的滤器及滤膜。 若需要冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗量一般为100ml，且冲洗量不宜过大修改为总冲洗量不得超过1000ml 。 水溶液供试品 含抑菌成分需用适量的冲洗液冲洗膜修改为所用的冲洗量、冲洗方法同方法验证试验.,装有药物的注射器供试品 取规定量，删去装上无菌针头.修改为排出注射器中的内容物至无菌容器中，若需要可吸入稀释液或标签所示的溶剂溶解，或非水溶性制剂供试品项下方法操作。 无菌气雾剂供试品 供试液的制备将供试品置冰室修改为置至少 -20的冷冻室约1小时。, 直接接种法删除内酰胺类或磺氨类供试品。,表1 、表2 、表3增修订,表1 （第3列）接种每种培养基改为所需的最少检验数量 表2 （表题）上市抽验样品（液体制剂）的最少检验数量修改为液体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量 第二列每支样品接入每管培养基的最少样品量修改为每支供试品接入每管培养基的最少样品量 第三列最少检验数量（瓶或支）1 全量 0 修改为供试品最少检验数量（瓶或支） 0 注 每种培养基各接种支供试品修改为若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基，那么表中的最少检验数量加倍。,表3 （表题）将上市抽验样品（固体制剂）的最少检验量 修改为固体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量” 第三列最少检验数量、1 全量 0 修改为供试品最少检验数量（瓶或支） 0 注 每种培养基接种支培养基修改为若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基，那么表中的最少检验数量加倍。,三： 微生物限度检查增修定内容,修改内容,1、培养条件 控制菌培养温度3537修改为3035(细菌、控制菌培养温度相同)。 修改理由 此温度适于所有中温菌生长，一些高温菌在该温度下也可以生长。,增修订内容,2、结果报告 特殊品种可以最小包装单位报告 特殊品种包括 药典规定微量包装药品的检验量可以酌减。 还有一些贵重药品也应考虑检验量。,3、检验量增修订内容,中药膜剂检验量50 cm2 修改为100cm2 。 沙门菌检验量修改为检验量为20 g或20ml并注明（其中10 g用于阳性对照）。,4、供试液的制备增修订内容,供试品检查时使用表面活性剂应证明其对 微生物生长和存活无影响修改为无毒性。 供试液的制备若需加温时，可采用其他经 验证的方法，但应均匀加热，且温度不应超 过45。,新增贴剂供试液制备,供试液的制备 经验证方法制备成供试液在无菌环境进行。 避免粘贴面粘合在一起。 置于含有表面活性剂（如聚山梨酯80或卵磷脂）的稀释剂中，制成供试液。 充分振摇。 也可采用以其他适宜的方法制备成供试液。,具抑菌活性的供试品增修订内容,删除应消除供试液的抑菌活性修改为当供试品具有抑菌活性时，应尽量选择操作简便、快速的方法，应避免损伤供试品中污染的微生物。在供试品溶液性状允许的情况下，应尽量选用薄膜过滤法。,离心沉淀集菌法,两次离心修改为一次离心； 500转/分离心，不超过3分钟，取全部上清液用于检查。 影响因素 供试品 污染菌特性 适用范围 仅使用于微生物限度检查供试液的制备。 尽量避免使用，不可使用快速离心。,细菌、霉菌及酵母菌计数增修订内容,新增 计数培养基的适用性检查 菌种 大肠埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B） 44102 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（ B） 26 003 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CMCC（B） 63 501 白色念珠菌（Candida albicans）CMCC（F） 98 001 黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC（F） 98 003, 增加了菌悬液的制备及保存条件。 菌悬液制备后在室温下放置应在2小时内使用，若保存在28可以在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在 28，在验证过的贮存期内使用，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，按规定条件培养计数，同时用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 增加了对照培养。,2.新增常见干扰物的中和剂和灭活方法 参见 表1常见干扰物的中和剂或灭活方法,6、供试品检查增修订内容,平皿法 删去采用平皿法进行菌数测定时，连续23个稀释级的供试液。 修改为按计数方法的验证试验确认的程序进行供试液制备。,培养时间修改内容 除另有规定外，细菌培养48小时改为3天，霉菌、酵母菌培养72小时改为 5天，必要时，可适当延长培养时间至7天进行菌落计数并报告。,菌数报告规则增修订内容,若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。 细菌、酵母菌和霉菌平均菌落数在30300 、30100之间的稀释级修改为选取菌落数小于300cfu和100cfu的稀释级作为菌数报告的依据。,薄膜过滤法增修订内容,新增内容 采用其它直径的滤膜，冲洗量应相应的进行调整（如使用膜直径增大冲洗液量也应相应增加，可保证冲洗液覆盖整个滤膜）。 删去每片滤膜的总过滤量不宜过大，修改为总冲洗量不得超过1000ml。,7、控制菌检查增修订 增加控制菌检查用培养基的适用性检查； 检查项目包括促生长、抑制及指示能力检查参照表2,新增培养基适用性检查方法 液体培养基促生长能力检查。 固体培养基促生长能力检查。 培养基抑制能力检查。 液体培养基指示能力检查。 固体培养基指示能力检查。 试验结果与对照培养基比较,控制菌检查用培养基的适用性检查,控制菌检查用培养基的促生长、抑制及指示能力检查 控制菌检查 培养基 特性 试验菌株 大肠埃希菌 胆盐乳糖 促生长能力 大肠埃希菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌 MUG 促生长能力+指示能力 大肠埃希菌 曙红亚甲蓝 或麦康凯 促生长能力+指示能力 大肠埃希菌 大肠菌群 乳糖胆盐 促生长能力 大肠埃希菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌 乳糖发酵 促生长能力+指示能力 大肠埃希菌 曙红亚甲蓝 或麦康凯 促生长能力+指示能力 大肠埃希菌,沙门菌 营养肉汤 促生长能力 乙型付伤寒沙门菌 四硫磺酸钠亮绿 促生长能力 乙型付伤寒沙门菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌 胆盐硫乳琼脂或沙门、 志贺氏属琼脂培养基 促生长能力+指示能力 乙型付伤寒沙门菌 曙红亚甲蓝琼脂 或麦康凯琼脂 培养基 促生长能力+指示能力 乙型付伤寒沙门菌 三糖铁琼脂 培养基 指示能力 乙型付伤寒沙门菌 铜绿假单 胆盐乳糖 促生长能力 铜绿假单胞菌 胞菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌 溴化十六烷基三 促生长能力 铜绿假单胞菌 甲铵琼脂 抑制能力 大肠埃希菌 绿脓菌素测定 用培养基 促生长能力+指示能力 铜绿假单胞菌 金黄色葡 亚碲酸盐肉汤 促生长能力 金黄色葡萄球菌 萄球菌 抑制能力 大肠埃希菌 卵黄氯化钠琼脂促生长能力+指示能力 金黄色葡萄球菌 或甘露醇盐琼脂 抑制能力 大肠埃希菌 梭菌 梭菌增菌培养基 促生长能力 生孢梭菌 哥伦比亚琼脂 促生长能力 生孢梭菌 白色念 沙氏葡萄糖肉汤 促生长能力 白色念珠菌 珠菌 沙氏葡萄糖琼脂 促生长能力+指示能力 白色念珠菌 念珠菌显色培养基 促生长能力+指示能力 白色念珠菌 吐温80玉米琼脂 促生长能力+指示能力 白色念珠菌,控制菌检查法增修订内容,疑似致病菌的确证 微生物控制菌检查中没有规定进一步确证疑似致病菌的方法。选择已被认可的菌种鉴定方法。如伯杰氏细菌鉴定手。 控制菌检查方法验证 删去阴性菌对照组。,大肠菌群检查用胆盐乳糖培养基改为乳糖胆盐。 改梭菌检查用庖肉培养基为梭菌增菌培养基。 改梭菌培养时间7296小时为48小时。,增加了白色念珠菌检验方法,增菌培养 沙氏葡萄糖肉汤培养基。 分离培养 划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上。,鉴定试验,典型菌落 沙氏葡萄糖琼脂培养基 菌落呈乳白色偶见淡黄色，表面光滑有浓 酵母气味，时间稍久则菌落增大，颜色变 深、质地变硬或有皱摺。 念珠菌显色培养基 菌落呈绿色或翠绿色菌落生长。,确认试验 取1%吐温80-玉米琼脂 培养基培养物进行染色，镜检及芽管 试验。 结果判断 非革兰阳性菌，显微镜下未见厚膜孢子、假菌丝、芽管判未检出白色念珠菌。,新增微生物限度检查法指导原则,一、抑菌剂效力检查法指导原则 二、药品微生物检验替代方法验证指 导原则 三、微生物限度检查法应用指导原则 四、药品微生物实验室规范指导原则,一、抑菌剂效力检查法指导原则,指导原则的目的 是为测定灭菌、非灭菌制剂中抑菌剂的活性，以评价最终产品的抑菌效力及生产企业在制剂研发阶段抑菌剂的确定提供指导。 为防止药品由于微生物污染而引起变质，对服用者造成不良反应，在药品生产过程中加入一定剂量的抑菌剂。 抑菌剂不能用于替代药品生产的GMP管理，不能作为非灭菌制剂降低微生物污染的唯一途径，也不能作为控制多剂量包装制剂灭菌前的生物负载的手段。,使用范围及原则,使用范围 如果药物本身不具有充分的抗菌活性，应根据制剂特性添加适宜的抑菌剂，以防止制剂在正常贮藏和使用过程中可能发生的微生物污染和繁殖，对患者造成伤害。,使用原则,所有抑菌剂都具有一定的毒性，添加抑菌剂时应注意以下原则: 抑菌剂的用量应为最低有效量。 具有抗菌活性的制剂应确认其抗菌效力。,应验证最终容器中的抑菌剂效力在效期内不因贮藏条件而降低。 本试验方法和抑菌剂抑菌效力判断标准用于包装未启开的成品制剂。,抑菌剂抑菌效力的测定,供试品的分类 分为四类，但对于一些抗酸性制剂和含活生物制剂应考虑会降低有益菌的生物活性。见表1,表1 产品分类 类别 药品 1 类 注射剂、 其他非肠道制剂， 包括 乳剂、耳用制剂、无菌鼻用制剂及眼 用制剂 2 类 局部给药制剂、非灭菌鼻用制剂及用于 黏膜的乳剂 3 类 口服非固体制剂（非抗酸制剂） 4 类 非固体抗酸制剂,培养基,培养基的制备 胰酪胨大豆肉汤琼脂培养基 胰酪胨大豆肉汤培养基 沙氏葡萄糖肉汤培养基 培养基的适用性检查 同控制菌培养基 的适用性检查,抑菌剂效力测定方法,菌种 菌液制备 菌种 同培养基适用性检查，制剂中常见的污 染微生物也可作为试验菌。 菌液制备 制成每1ml含菌数约为108cfu的菌悬液。 供试品接种影响因素给予指导 容器的材质、形状、体积、封口方式及容器的PH等分别给予了指导。,接种菌量 接种菌液的体积不得超过供试品体积的0.5%1%。 放置 2025，避光贮存，贮存温度的变化应尽可能控制在最小范围，并防止被污染。,存活菌数测定 采用经验证的方法进行试验，计算1ml(g)供试品各试验菌所得的菌数及各间隔时间的菌数，并换算成lg值。,结果判断 结果符合表3要求，可判断该产品抑菌效力符合规定。,表3 抑菌剂抑菌效力判断标准 1 类 供 试 品 细菌 7天菌数下降不少于1.0 lg，14天菌数下降不少于 3.0lg,14天到28天菌数不增加。 真菌 与初始值比，7、14、28天菌数均不增加。 2 类 供 试 品 细菌 14天菌数下降不少于2.0 lg，14天到28天菌数不增加。 真菌与初始值比，14、28天菌数均不增加。 3 类 供 试 品 细菌 14天菌数下降不少于1.0 lg，14天到28天菌数不增加。 真菌 与初始值比，14、28天菌数均不增加。 4 类 供 试 品 细菌，真菌 与初始值比，14、28天菌数均不增加。 注：1、表中“不增加”是指对前一个测定时间，试验菌增加的数量 不超过0.5 lg。 2、0时菌数(初试值) 供试品加入试验菌，摇匀，立即取样检 查，培养，计数，为0时菌数。,二、药品微生物检验替代方法验证指导原则,目的 是为所采用的试验方法能否替代药典规定的 方法用于药品微生物的检验提供指导。 在控制药品微生物质量中，需要采用替代方 法 时，应进行方法的验证，确认其应用效果 优于或等同于药典的方法。,微生物检验的类型及验证参数 药品微生物检验方法主要分两种类型 定性试验 定量试验 生物试验的特殊性 抽样误差 操作误差 稀释误差 培养误差 计量误差 计数误差 药品质量标准分析方法验证指导原则不完全 宜于微生物替代方法的验证。,表1、 不同微生物检验类型验证参数表 参数 定性检验 定量检验 准确度 精密度 专属性 检测限 定量限 线性 范围 耐用性 重现性 注： 表示需要验证的参数 表示不需要验证的参数 逐项按替代方法验证的要求进行验证和评价以便操作者了解方法的关键操作点,替代方法验证的一般要求,适用性验证前，对替代方法有一个全面的了解； 由替代方法的研发者提供，或由方法使用者完成。 验证应至少使用2 个批号的样品，每批样品应 平行进行至少3 次独立实验。 在开展各参数验证时，除规定的菌株外，还应 根据替代方法及样品的特点增加相应的菌株。