肺结核的新诊断技术.ppt

新诊断技术及其在NTP中的应用,江苏省结核病参比实验室,NTP中现行实验室技术,涂片：萋尼染色显微镜检 培养：固体培养基：简单法、离心法 药敏：固体培养基：绝对浓度法、比例法 菌种鉴定：鉴别培养基生化试验 传统实验室技术不能适应不断深入的结核病防治工作的需要,实验室新诊断技术总览,细菌学检测方法 发光二极管荧光显微镜（LED） 液体培养 分子生物学检测方法 Genexpert HAIN Genechip 免疫学检测方法 ELISOPT&TSPOT 和Quantiferon 血清学诊断方法,荧光 比色 (MIGIT) (MB Bact Alert),Ruthenium complex,液体培养,BACTEC TB460,原理：标本经前处理接种至含有14C-棕榈酸的12B培养基，37C培养。分枝杆菌分解14C-棕榈酸，产生14CO2，BACTEC TB460仪自动检测，14CO2含量，并换算成生长指数（GI）。 优点： 快速：将分离培养的阳性检出时间由常规培养所需的2-8周缩短至3-14天，将药敏试验的报告时间由常规方法的4周缩短至1周。 操作简便、灵敏度高，可进一步做药敏试验、菌种初步鉴定。 缺点： 放射性同位素污染。 仪器与试剂价格昂贵。 未实现全自动化 污染率高,原理：是BACTEC TB460的换代产品。标本经前处理后接种到系统配套的液体培养基，该培养基中包被有对氧浓度敏感的荧光物质，当细菌生长代谢消耗培养基中的氧时，氧浓度降低，荧光被激发，系统可以连续检测荧光水平，自动报告结果。 优点： 系统进一步优化，操作更简便、自动化更强。 解决了BACTEC TB460的同位素污染问题。 24小时连续检测，有利于早期报告阳性结果。 缺点： 仪器与试剂价格更昂贵。 未能解决高污染率的问题,BACTEC MGIT 960 分枝杆菌生长指示管,液体培养,1Cruciani M, et al. JCM 2004; 42:2321-2325 2 Mean of 14 studies in MGIT960 = 10.7% (2.0-30.0) = acceptable range,MGIT 7 ml,MGIT 7 ml,MGIT 7 ml,MGIT 7 ml,MGIT 7 ml,MGIT 7 ml,MGIT 7 ml + S,MGIT 7 ml + I,MGIT 7 ml + R,MGIT 7 ml + E,GC,S,I,R,E,0,8 ml BACTEC MGIT SIRE 补充剂,每种药物0,1 ml,转移 0,5 ml 阳性 MGIT 培养物,0,1 ml 阳性 MGIT 培养物,9,9 ml 蒸馏水,转移 0,5 ml,插入BACTEC MGIT 960,BACTEC MGIT 960 TB 药敏试验 S.I.R.E.,LED显微镜,发光二级管 (LED) 技术 提供价廉、稳定的光源 寿命 150,000 h 反复开关不影响寿命 不释放有毒气体 不需要暗室 操作人员工作负荷减轻,快速药敏-商业化线性探针检测（LPAs）,GenoType MTBDRplus, HAIN 检测结核分枝杆菌复合群以及利福平、异烟肼耐药相关的突变 检测XDR的试剂盒也已经发布 INNO-Lipa Rif TB 检测结核分枝杆菌复合群以及于利福平耐药相关的突变 大多数利福平耐药的菌株同时也耐异烟肼 WHO 鼓励使用的工具 可使用涂阳痰标本和培养物进行操作 快速、简便易用，仅需基本PCR技术 然而，价格比较昂贵，且不能检测造成耐药突变的热点区域外的突变,11,MTBDRplus 操作流程,DNA提取 用NALC/NaOH 处理痰标本,2) PCR扩增,3) 杂交 扩增产物和 固化在 膜上的特异性探针杂交,4) 结果判读,rpoB 野生型探针: WT1 - WT8 rpoB 突变探针: MUT1-3: D516V, H526Y, H526D, S531L 野生型缺失 野生型突变,MTBDRplus rpoB,katG 基因突变,MTBDRplus katG,MTBDRplus inhA,inhA 基因突变,MTBDRplus 反应条带(示范),南非的经验：,Genotype MTBDR plus assay: 直接从涂片阳性标本中检测rpob基因突变 (耐利福平), katG 基因 (高浓度异烟肼耐药), inhA 基因(低浓度异烟肼耐药) 灵敏度、特异度，阳性预测值、阴性预测值 耐利福平 98.9, 99.4, 97.9, 和99.7 耐异烟肼 94.2, 99.7, 99.1, 和 97.9 耐MDR-TB 98.8, 100, 100, 和 99.7,Barnard M, et al. Am J Respir Crit Care Med 2008;177:787-92,结核耐药检测基因芯片,激光共焦扫描仪,软件判读,结核耐药检测芯片获北京市自主创新产品证书,样品制备仪,杂交仪,通 量：两个一线抗结核药 速 度： 6 小时（比传统药敏试验法快 50-100 倍） 灵敏度：103 CFU/反应 特异性：对照设计严谨；自动判读,基于rpoB/katG/inhA的基因突变，快速检测分离株或者痰样本中结核杆菌多药耐药（利福平、异烟肼）。,International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, 13:914-920, 2009（IF=2.3）,18,获国家医疗器械证书和欧盟CE认证,Xpert MTB/RIF,检测结核分枝杆菌 检测利福平耐药 直接标本检测 100分钟可获得结果,工作流程 痰 简单，仅需1个步骤的准备工作 获得结果的时间 16 样本 / 天 / 模块 不需要生物安全规 综合控制 性能 对 MTB特异 敏感性与培养相似 通过rpoB 基因检测利福平耐药 产品和系统设计 GeneXpert 系统的检测模块 测试模块的扩大和交换 对非分枝杆菌实验室人员仅需要最多1天的培训,GeneXpert,样本准备、扩增、检测自动化,MTB / 利福平耐药性检测,痰标本可以直接放入模块中，而无需与任何试剂进行混合处理,Xpert MTB/RIF,单中心评估研究（初步结果）,不同研究设计和研究人群，肺结核和肺外结核标本 检测结核 汇总的未经校正的敏感性 92% 汇总的未经校正的特异性 98% 检测利福平耐药 汇总的未经校正的敏感性 98% 汇总的未经校正的特异性 99%,操作方面,废弃物管理 如痰标本容器 储存和供应 反应盒庞大, 2 - 28C, 有效期12个月 电力供应 UPS (400 VA) 或电池组 培训 需求不高 (使用计算机、预防污染) 生物安全 与涂片镜检相同 每年校正 模块更换 安全 防盗 (计算机),世界卫生组织 快速开展Xpert MTB/RIF诊断试验 技术和实施方面的考虑 2011年3月,WHO对Xpert MTB/RIF的建议摘要：,高度推荐用于怀疑MDR-TB以及合并HIV感染的结核病病人的初诊诊断 对于MDRTB、HIV不严重的地区，可以在涂片之后考虑使用Xpert MTB/RIF，特别是用于诊断涂阴病人（取决于费用） 肺外标本的有关证据尚有限 增加检测次数可能增加敏感性，但需考虑费用增加 适用于儿童 不能替代传统涂片、培养、药敏试验,步骤 1: 特异抗原激发淋巴细胞,IFN- 释放,阴性对照,ESAT-6 或 CFP-10,孵育,孵育,显影,步骤 2: 用ELISA 检测 IFN- ,Y Y Y,Y,Y,Y,Y Y Y,洗涤,Y Y Y,Y,Y,Y,洗涤,Y Y Y,QuantiFERON TB Gold实验,T-SPOT TB (ELISPOT)技术,单核细胞分离,TB抗原刺激，IFN- 释放,一抗捕获IFN-,与标记的二抗结合,酶作用标记物显色,每一斑点代表释放IFN-的一个细胞,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,IFN-,抗原,小 结,NTP中如何应用 给谁用？哪里做？怎么用？,国家结核病参比实验室推荐建议,液体培养用于: 结核病可疑症状者检查, 可以作为结核病（耐药）的诊断依据和结核病患者治疗效果判断, 液体培养可以代替传统培养,推荐理由: 液体培养在已经在我国注册； 国内外研究显示其敏感性和TAT优于传统培养； 数据显示在我国具有可行性,符合成本效果；,推荐使用层级: 区县、地市和省级（医疗机构和疾病预防机构）,国家结核病参比实验室推荐建议,GenXpert 即将可以用于: 结核病可疑症状者检查, 可以作为结核病的辅助诊断方法和结核病患者治疗效果判断, 它有望代替传统的培养和利福平的药敏试验（可疑耐药结核病患者）,推荐理由: 即将在我国获得注册证书； 国内外研究显示其敏感性和特异性，阳性结果报告时间优于传统方法； WHO 在全球推荐 数据显示在我国具有可行性,符合成本效果；,可能使用层级: 区县（？）、地市和省级（医疗机构和疾病预防机构）,国家结核病参比实验室推荐建议,LPA可以用于: 可疑耐药结核病患者查,它有望代替利福平和异烟肼的传统药敏试验,推荐理由: 在我国获得注册证书； 国内外研究显示其敏感性和特异性（TAT)较好； WHO 在全球推荐 数据显示在我国具有可行性,符合成本效果；,可能使用层级: 地市和省级（医疗机构和疾病预防机构）,国家结核病参比实验室推荐建议,基因芯片可以用于: 可疑耐药结核病患者查,它有望代替利福平和异烟肼的传统药敏试验,推荐理由: 在我国获得注册证书； 国内研究显示其敏感性和特异性和(TAT)较好； 民族品牌 数据显示在我国具有可行性,符合成本效果；,可能使用层级: 地市和省级（医疗机构和疾病预防机构）,国家结核病参比实验室推荐建议, 干扰素释放试验可以用于: 结核菌潜伏感染筛查,儿童和老年人以及免疫力低下者结核病的辅助诊断（参考）,推荐理由: 在我国获得注册证书，国家对一些特殊诊断试剂的规定； 国内外研究显示其敏感性和（特异性）较好； 数据显示在我国具有可行性,可能使用层级: 县区、地市和省级（医疗机构和疾病预防机构）,