药用酶的生产技术.ppt

酶的生产方法,提取分离法 (Extraction),生物合成 (Biosynthesis),化学合成 (chemicalsynthesis),SOD - blood Papain-Papaya Chymotrypsin-Pancrea organ/tissue/cell,Amylase from Bacillus Protease from Bacillus Phosphatase from Bacillus Glucoamylase from Aspergillus Plant cell culture Animal cell culture,Few example,第二节 药用酶的生产技术,一、酶生物合成过程及其调节,二、常见产酶微生物,三、酶的发酵工艺条件及控制,4、酶生产过程的动力学,Go,Go,Go,Go,5、动植物细胞培养产酶，自学,一、 酶的生物合成及其调节,1、中心法则- Central Dogma,2、RNA的生物合成- Transcription,3、蛋白质的生物合成- Translation,4、酶生物合成的调节- Regulation,Go,Go,Go,Go,1、中心法则-Central Dogma,Replication 复制：亲代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。 Transcription 转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则将其所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。 Translation 翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的AA顺序的过程。 Reverse translation 逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。,2、RNA的生物合成(转录)- Transcription,细胞内RNA的生物功能,(1) 在某些RNA病毒中，其所含的双链RNA作为遗传信息的载体。,(2) 在蛋白质的生物合成过程中，各种RNA起着重要的作用。其中，tRNA作为氨基酸载体，并由其上的反密码子识别mRNA分子上的密码子；mRNA作为蛋白质合成的模板，由其分子上的三联体密码控制蛋白质分子中氨基酸的排列顺序；rRNA与蛋白质一起组成核糖核蛋白体（核糖体），作为蛋白质生物合成的场所。,(3) 某些RNA具有生物催化活性，属于核酸类酶，在一定条件下，可以催化有关的生化反应。,(4) 各种小分子RNA在分子修饰和代谢调节等方面有重要作用。,转录过程的特点,1、转录的不对称性：在RNA的合成中，DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。,反义链 antisense strand（无意义链，负链）：在RNA的转录中，用作模板的DNA链称为反义链。 有义链 coding strand（编码链，正链）：在RNA的转录中，不作为模板的DNA链称为有义链。,2、转录所需酶：依赖DNA的RNA聚合酶又称为转录酶，是以DNA为模板的一类RNA聚合酶。在原核生物和真核生物中，转录酶有所不同。原核生物的转录酶比较简单，由1种RNA聚合酶催化所有RNA的生物合成。而在真核生物中RNA聚合酶有3种，分别为RNA聚合酶、RNA聚合酶和RNA聚合酶，它们都属于寡聚酶，酶的亚基数目为410个，亚基种类有46种。,转录过程,起始位点的识别 recognition 转录起始 initiation 链的延伸 elongation 转录终止 termination 转录后加工 modification,The E. coli RNA polymerase holoenzyme consists of six subunits: a2bb s.,Possible catalytic subunits,Promoter specificity,Enzyme assembly, promoter recognition, activator binding,Role unknown (not needed in vitro),36.5 kDa,151,155,11 kDa,(32-90 kDa),3、蛋白质的合成(翻译)-Translation,翻译: 以RNA中mRNA为模板,按照其 核苷酸顺序所组成的密码指 导蛋白质的合成的过程.,mRNA,蛋白质,翻译,各种信息 各种蛋白质,（核苷酸排列顺序） （氨基酸排列顺序）,蛋白质合成的几个要素(1)-mRNA(模板),mRNA是带有DNA遗传信息指导蛋白质合成的直接模板。 以mRNA为模板,合成一定结构的多肽链的过程(翻译)，就是将mRNA分子中的核苷酸排列顺序转变成蛋白质分子中的氨基酸排列顺序。,蛋白质合成的几个要素(2)-遗传密码,mRNA分子中,每三个相邻的核苷酸组成的三联体代表某种氨基酸或其它信息，称为密码子或三联密码。 四种核苷酸编成三联体可形成43个即64个密码子。其中： 一个起始密码: AUG 三个终止密码: UAA UGA UAG 多数氨基酸拥有 2-4个密码,蛋白质合成的几个要素(3)- 转运RNA,tRNA是氨基酸的转运工具，携带活化的氨基酸到核蛋白体。 tRNA有特异性，至少有20种以上。每种tRNA的反密码环顶端均有由三个核苷酸组成的反密码，能与mRNA上相应的密码互补结合。,酪,5,5,3,AUG,GUU UAC ACA,酪氨酰- tRNA,反密码,mRNA,密码(codon)与反密码(anticodon)的碱基配对,蛋白质合成的几个要素(4)-核糖体,核糖体（或称核糖核蛋白体）由蛋白质和rRNA组 成。是存在于细胞质内的微小颗粒。,The ribosome composition of prokaryotic and eukaryotic cell,蛋白质的合成过程,肽链合成的起始 肽链合成的延伸 肽链合成的终止与释放 合成多肽的输送和加工 蛋白质分子的折叠,高效率的蛋白质合成体系,4、酶生物合成的调节 (regulation),基因水平的表达控制 酶含量的调节 操纵子（operon）：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位。,酶在细胞内的含量取决于酶的合成速度和分解速度。细胞根据自身活动需要，严格控制细胞内各种酶的合理含量，从而对各种生物化学过程进行调控。 酶浓度调节的化学本质是基因表达的调节。在细胞内，所合成的酶的种类及数量是由特殊的基因信息决定的。DNA所携带的酶蛋白遗传信息，需要通过转录和翻译而合成酶蛋白。在细胞内进行的转录或翻译过程都有特定的调节控制机制，其中转录的调控占主导地位。因此，基因表达的调控主要在转录水平上进行。,本世纪三十年代，H.Karstrom在对糖代谢过程中的某些酶的合成进行研究时提出：诱导酶与组成酶。,(1)、原核生物中酶生物合成的调节 (regulation),原核生物中酶生物合成的调节主要是转录水平的调节，又称基因的调节。该理论最早由Jacob and Monod提出。 根据这一理论，在DNA分子中，与酶的生物合成有密切关系的基因有四种： 调节基因、启动基因、操纵基因和结构基因。 操纵基因可以与调节基因产生的变构蛋白（阻遏蛋白）中的一种结构结合，从而操纵酶生物合成的时机和合成速度。 启动基因决定酶的合成与否，它由两个位点组成：一个是RNA聚合酶的结合位点，另一个是环腺苷酸（cAMP）与环腺苷酸受体蛋白（CAP）组成的复合物的结合位点。,结构基因与操纵基因、启动基因一起组成操纵子。原核生物中主要有两种类型：诱导型和阻遏型。 诱导型操纵子：在无诱导物存时，其基因表达水平很低或不表达，只有在诱导物存在的条件下，才能转录生成mRNA，进而合成酶，如乳糖操纵子等。 阻遏型操纵子：在无阻遏物存在下，基因正常表达，当有阻遏物存在时，转录受阻，如色氨酸操纵子等。 另外，启动基因位点上cAMP-CAP复合物的结合与否，亦对酶的生物合成起到调节作用。 转录水平的调节主要有三种模式：分解代谢物阻遏作用、酶合成的诱导作用和酶合成的反馈阻遏作用。, 分解代谢物阻遏作用 分解代谢物阻遏作用是指某些物质经过分解代 谢产生的产物阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合 成的现象。 原因：易分解物经过分解产生ATP，消耗掉AMP，进而 消耗cAMP，同时腺苷酸环化酶的活化受到抑制而使cAMP 的合成受阻，从而导致cAMP的浓度降低。这必然导致 cAMP-CAP复合物的浓度随之降低，结果启动基因的相应位 点上没有足够的cAMP-CAP复合物结合，RNA聚合酶也就 无法结合到启动基因的相应位点上，转录无法进行，酶的生 物合成受到阻遏。, 酶合成的诱导作用： 加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速进行的过程，称为酶生物合成的诱导作用（简称诱导作用）。,酶合成诱导的现象Jacob and Monod的工作： 已知分解利用乳糖的酶有：-半乳糖苷酶；-半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。 实验： a.大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成； b.大肠杆菌生长在唯一碳源乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；当换成葡萄糖培养基时，三种酶基本消失； c.表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。,某些代谢物可以诱导某些酶的合成，是通过促进为 该酶编码的基因的表达而进行的，这种现象叫做酶合成 的诱导。能诱导酶合成的物质叫诱导物。被诱导合成的 酶叫诱导酶。,细菌乳糖操纵子的作用机制(降解物阻遏),调节基因,启动子,操纵 基因,lacZ,lacY,lacA,CAP,cAMP,CAP-cAMP 复合物,mRNA,当葡萄糖作唯一碳源时，葡萄糖的降解物对腺苷酸环化酶有抑制作用，则cAMP的浓度降低，CAP-cAMP复合物减少，不能与启动子结合，故转录不得进行。,+,乳糖操纵子的结构,诱导机制, 酶合成的反馈阻遏作用（又称产物阻遏作用）： 是指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的过程。引起反馈阻遏作用的物质称为共阻遏物。,酶合成阻遏的现象Jacob and Monod的工作： 实验： 1.大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在； 2.在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。 3.表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌生长的经济原则：不需要就不合成。,某些代谢物可以阻止某些酶的合成，是通过阻止 为该酶编码的基因的表达而进行的，这种现象叫做酶 合成的阻遏。能阻遏酶合成的物质叫辅阻遏物。被辅 阻遏物作用而停止合成的酶叫阻遏酶。,调节基因,操纵基因,结构基因,mRNA,酶蛋白,阻遏蛋白不能与操纵基因结合， 结构基因表达,调节基因,操纵基因,结构基因,辅阻遏物trp,代谢产物与阻遏蛋白结 合，使之构象发生变化 与操纵基因结合，结构基因不能表达,色氨酸操纵子（酶的阻遏） -阻遏物和操纵基因的调节,(2)、真核生物合成的调节,真核生物比原核生物的结构复杂，其基因的表达 和调控亦复杂得多，目前尚无统一的理论和模型来阐 述真核生物中酶生物合成的调节规律。 细胞分化改变酶的生物合成（参见P187） 抗原诱导抗体酶的生物合成（参见P188）,二、药用酶生产细胞的选择,基本要求： 不是致病菌 发酵周期短,产酶量高 不易变异退化 最好是产生胞外酶的菌种,利于分离。 对医药和食品用酶,还应考虑安全性： 凡从可食部分或食品加工中传统使用的微生物生产的酶,安全! 由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性实验。 非常见微生物制取的酶,需做广泛的毒性实验,包括慢性中毒实验。,（一）微生物,(1) 大肠埃希氏杆菌，简称为大肠杆菌，是最为著名的原核生物。,形态：短杆或长杆状，0.51.01.03.0 um，革兰氏阴性，运动(周毛)或不运动，无芽孢，一般无荚膜。菌落呈白色至黄白色，扩展，光滑，闪光。 Escherich属菌株和大多数大肠杆菌是无害，但也有些大肠杆菌是致病的，会引起腹泻和尿路感染。 大肠杆菌的名声主要因它易于在实验室操作、生长迅速，而且营养要求低。 应用： 大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁殖 大肠杆菌也是最早用作基因工程的宿主菌 工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和 制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等,(2) 醋酸杆菌（Acetobacter）,菌体从椭圆至杆状，单个、成对或成链，革兰氏阴性，运动（周毛）或不运动，不生芽孢。好气。含糖、乙醇和酵母膏的培养基上生长良好。 应用：有机酸(食醋等）葡萄糖异构酶(高果糖浆 )山梨糖 (维C中间体）,(3)枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）,直状、近直状的杆菌，周生或侧生鞭毛，革兰氏阳性，无荚膜，芽孢0.51.51.8m，中生或近中生。 枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一。生产淀粉酶、蛋白酶、5-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。,(4) 根霉(Rhizopus),分类学上属于藻状菌纲，毛霉目，根霉属。 根霉因有假根（Rhizoid）而得名（假根的功能是在培养基上固着，并吸收营养）。 分布于土壤、空气中，常见于淀粉食品上，可引起霉腐变质和水果、蔬菜的腐烂。 代表种：米根霉（R.oryzae)黑根霉(R.nigrican)等。 应用：根霉能产生一些酶类，如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等，是生产这些酶类的菌种。在酿酒工业上常用做糖化菌。有些根霉还能产生乳酸、延胡索酸等有机酸。,(6)曲霉(Aspergillus),分类：多数属于子囊菌亚门，少数属于半知菌亚门。 分布：广泛分布于土壤、空气和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐变质，有的可产生致癌性的黄曲霉毒素。 代表种：黑曲霉Asp. Niger、黄曲霉Asp.flavus 应用：是制酱、酿酒、制醋的主要菌种。是生产酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌种。生产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸等）。农业上用作生产糖化饲料的菌种。,回本节,（二）植物细胞 植物细胞培养主要用于色素、药物、香精、 酶等次生代谢物的生产（参见P190）。,（三）动物细胞 动物细胞培养主要用于疫苗、抗体、激素、多 肽、酶等功能蛋白的生产，通过该方法生产的药用 酶不多（参见P190）。,三、药用 酶的生产工艺条件与控制,2、培养基,3、发酵条件及控制- Transcription,4、提高产酶的措施- Translation,Go,Go,Go,Go,1、药用酶生产的工艺过程,（一）、药用酶生产的工艺过程,酶生产的工艺流程（参见P190）,1、大肠杆菌发酵生产天冬酰胺酶（参见P191）,2、大蒜细胞培养生产超氧化物岐化酶（参见P191）,3、人黑色素瘤细胞培养生产组织纤溶酶原激活剂（参见P191）,（二）、培养基,各种生物对营养的需求,1、选择适宜的营养物质 2、营养物的浓度及配比合适 3、物理、化学条件适宜 4、经济节约 5、精心设计、试验比较,培养不同的微生物必须采用不同的培养条件； 培养目的不同，原料的选择和配比不同； 不同阶段，培养条件也有所差异。,培养基的设计原则,五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水,培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础,培养基（medium）是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。,任何培养基都应该具备微生物生长所需要五大营养要素,构成细胞物质或代谢产物中碳架,碳源可作能源，为生命活动提供能量,常用碳源：糖类、醇类、脂类、有机酸、烃类、蛋白质及其降解物,异养微生物：糖类是最好碳源（葡萄糖最为通用）,水是微生物最基本的组成分（-） 水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物） 水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动 调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）,水,碳源,选择合适碳源，以适应目的酶的合成调节机制,构成细胞物质和代谢产物中氮素（不能用作能源 ）,氮源,有机氮源,蛋白胨、酵母膏、牛肉膏,无机氮源,铵盐、硝酸盐,参与酶的组成、构成酶活性基、激活酶活性 维持细胞结构的稳定性 调节细胞渗透压 控制细胞的氧化还原电位 有时可作某些微生物生长的能源物质,常用：硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及含有钾、钠、钙、镁、铁等元素的化合物。,氮源,无机盐,需要注意合适的碳氮比,生长因子,生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物质进行合成，而必须另外加入少量的生长需求的有机物质。,分类： 化学结构分成维生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍生物和类脂成分等四类,功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应,实验室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作为各种生长因子的的需要，麦芽汁、米曲汁等天然培养基中本身含有各种生长因子,实验室的常用培养基： 细菌：牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）； 放线菌：高氏1号合成培养基培养； 酵母菌：麦芽汁培养基； 霉菌：查氏合成培养基；,例如枯草芽孢杆菌： 一般培养：肉汤培养基或LB培养基； 自然转化：基础培养基； 观察芽孢：生孢子培养基； 产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；,枯草杆菌BF7658-淀粉酶发酵培养基：玉米粉8%，豆饼粉4%，磷酸氢二钠 0.8%，硫酸铵0.4%，氯化钙0.2%，氯化按0.15%（自然pH）。 枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶发酵培养基：玉米粉4%，豆饼粉3%，麸皮3.2%, 糠1%, 磷酸氢二钠0.4%, 磷酸二氢钾0.03%（自然pH）。 黑曲霉糖化酶发酵培养基：玉米粉10%，豆饼粉4%，麸皮1%（pH4.45.0）。 地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶发酵培养基：玉米粉5.5%, 豆饼4%, 磷酸氢二钠0.4%, 磷酸二氢钾0.03%(pH 8.5)。 黑曲霉AS 3.350酸性蛋白酶发酵培养基: 玉米粉6%, 豆饼粉4%, 玉米浆0.6%, 氯化钙0.5%, 氯化铵1%, 磷酸氢二钠0.2% (pH 5.5)。 游动放线菌葡萄糖异构酶发酵培养基：糖蜜2%，豆饼粉2%，磷酸氢二钠0。1%，硫酸镁0。05% (pH 7.2)。 桔青霉磷酸二酯酶发酵培养基：淀粉水解糖5%，蛋白胨0.5%, 硫酸镁0.05%, 氯化钙0.04%, 磷酸氢二钠0.05%, 磷酸二氢钾0.05% (自然pH)。 黑曲霉AS3.396果胶酶发酵培养基: 麸皮5%, 果胶0.3%, 硫酸铵2%, 磷酸二氢钾0.25%, 硫酸镁0.05%, 硝酸钠0.02%, 硫酸亚铁0.001% (自然pH)。 枯草杆菌AS1.398碱性磷酸酶发酵培养基: 葡萄糖0.4%, 乳蛋白水解物0.1%, 硫酸铵1%, 氯化钾0.1%, 氯化钙0.1mmol/L, 氯化镁1.0mmol/L, 磷酸氢二钠20mol/L ( 用pH7.4的Tris-HCl缓冲液配制),回本节,（三）、发酵条件及控制,培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁 殖或产生代谢产物。为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培养基中加 入pH缓冲剂，或在进行工业发酵时补加酸、碱。,通常培养条件： 细菌与放线菌：pH77.5 酵母菌和霉菌：pH4.56范围内生长,1、pH值的控制,细胞发酵产酶的最适pH值与生长最适pH值往往有所不同。细胞生产某种酶的最适pH值通常接近于该酶催化反应的最适pH值。,有些细胞可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的pH值，往往可以改变各种酶之间的产量比例。,通常在生物学范围内每升高10，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。,2、温度的控制,有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同，而且往往低于生长最适温度。这是由于在较低的温度条件下，可以提高酶所对应的mRNA的稳定性，增加酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产量。,枯草杆菌的最适生长温度为3437,黑曲霉的最适生长温度为2832 ,3、溶解氧的控制,在酶的发酵生产过程中， 处于不同生长阶段的细胞，其细胞浓度和细胞呼吸强度各不相同，致使耗氧速率有很大的差别。 因此必须根据耗氧量的不同，不断供给适量的溶解氧。,培养液中溶解氧的量，决定于在一定条件下氧气的溶解速度。溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液的性质等有密切关系。一般说来，通气量越大、氧气分压越高、气液接触时间越长、气液接触面积越大，则溶氧速率越大。培养液的性