ITC等温滴定量热法的操作说明.ppt

等温滴定量热法 (Isothermal Titration Calorimetry, ITC),2011-10-13,2,Isothermal Titration Calorimetry, ITC,等温滴定量热技术（ITC）是一种监测由结合成分的添加而起始的任何化学反应的热力学技术，即用一种反应物滴定另一种反应物，随着加入滴定剂的数量的变化，测量反应体系温度的变化 它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息，它已经成为鉴定生物分子间相互作用的首选方法。 可获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数（Ka）、结合位点数（n）、摩尔结合焓（H）、摩尔结合熵（S）、摩尔恒压热容（Cp），和动力学参数(如酶促反应的Km和kcat）,3,独特特点：,它对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件，即具有非特异性的独特优势， 样品用量小，方法灵敏度和精确度高(仪器最小可检测热功率2 nW，最小可检测热效应0.125uJ，生物样品最小用量0.4ug，温度范围2 - 80 ，滴定池体积(1.43 ml)。 实验时间较短(典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间)， 操作简单(整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、注射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由Origin软件分析ITC得到的数据)。 测量时不需要制成透明清澈的溶液, 而且量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。 尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性，因此这种非特异性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规律，特别适应于研究生物体系中的各种特异过程。,4,Applications include:,Characterization of molecular interactions of small molecules Lead optimization. Enzyme kinetics. Assessment of the effect of molecular structure changes on binding mechanisms. Assessment of biological activity.,5,6,在恒温下，注射器中的“配体”溶液滴定到包含“高分子”溶液的池中。当配体注射到池中，两种物质相互作用，释放或吸收的热量与结合量成正比。当池中的高分子被配体饱和时，热量信号减弱，直到只观察到稀释的背景热量。,7,ITC系统是通过细胞反馈网络 CFB来分别测量或者补偿样品和对照由于反应所产生或者吸收的热量。两个硬币状的东西放置在绝热的圆筒中，通过那个细细的管子与外界联通。有两个热量检测装置。一个用来检测两个样品之间的热量差，另一个检测对照和环境的热量差。当样品中发生化学反应的时候，释放或者吸收热量，因此样品和对照的温度差会通过对样品进行增加或者减少热量而稳定在一个水平，就是baseline。因此那些用来维持T1=常数的热量就被系统检测画作曲线。,8,9,滴定一般在尽可能接近绝热的条件下进行，被滴定物可以是液体或悬浮的固体；滴定剂可以是液体或气体。温度变化是由滴定剂与被滴定物间的化学作用或物理作用（例如一种有机分子吸附于固体表面）引起的。 实验数据以热谱图形式表示，它提供了有关反应中物质的量（滴定终点）和反应物质的特性（焓变）的数据。对图进行分析，可以得知反应容器中发生的反应的类型和数目，以及溶液中存在的各物种的浓度等信息。这部分内容称为热滴定，同时还可以确定反应的化学计量关系，计算反应的热力学量,如平衡常数K(G)、标准状态下的焓变H和熵变S,这部分内容称为滴定量热法。 测温滴定法以热效应为基础,与溶液的许多性质(如粘度、光学透明度、介电常数、溶剂强度、以及离子强度等)无关,因此可以用于气相、液相、非水溶液、有色溶液、胶体溶液和粘稠浆状等体系。,10,典型的ITC数据 配体溶液20次注射到ITC池的蛋白溶液中。每个注射峰（上图）下方的区域与注射所释放的总热量相等。当这种综合的热量相对添加到池中的配体摩尔比作图时，就获得了相互作用的完整结合等温线（下图）。用单位点模型来验证数据。化学计量、结合常数及焓的数值都显示在框内。,11,12,ITC法测量结合/解离常数,ITC可以直接测量焓变H，结合常数Ka，而不对反应体系产生影响，也不引入修饰基团，因此测得的结果更加可信,13,14,15,（G）与总的结合亲和力直接相关，但不能了解结合机理。,ITC提供了（G）以及（H）和（S），产生了结合机理的真实图像。,作用机理研究与分析开发,16,ITC：用生物相关模型系统架起桥梁,ITC的关键