《生物样本分析》PPT课件.ppt

生物样本分析 岛津自动前处理系统 （Co-Sense for BA LCMS ）,药代动力学研究的内容,药代动力学应用动力学原理研究药物吸收、分布、代谢和排泄过程。 药物剂量与药理效应的相互关系研究 人体生理及病理状态对药物体内过程的影响 药物制剂的生物利用度测定 药物相互作用评价 生物样品包括各种体液和组织,血浆中微量药物或代谢产物的测定,药物化学结构的特点,世界药物索引1999收载 药物总数：51596 可离子化药物：62.9%，其中 酸性化合物14.5% 碱性化合物67.5% 两性化合物18.0% 分子量一般 500 离子化 质谱分析,血浆样品的特点,基质复杂 选择性强 待测物含量低 灵敏度高 浓度差异大 线性范围宽,生物样品中的药物分析前处理的要点 除蛋白质，分离纯化 浓缩 液液萃取法 固相萃取法 规模缩小的柱色谱法 直接沉淀法 超滤法,血浆样品加入提取溶媒（酸化或碱化）涡旋离心取上清液吹氮气浓缩残渣溶解过滤进样 色谱分析,样本前处理一般步骤,药代动力学研究面临的挑战,高效液相色谱法（HPLC）的特点和局限： 灵敏度：定量限一般为 10100 ng/ml，选择性差 测试速度：每个样品 1520 min，低通量 对结构分析提供的信息很少 需求： 灵敏度： ng/ml 浓度，高选择性 制剂生物等效性实验：5001000 样品 新药研究：分析超过 10000 个生物样品,液相色谱-质谱联用法的发展,1977年，LC/MS开始投放市场 1978年，LC/MS首次用于生物样品分析 1991年，API LC/MS用于药物开发,数据来源：American Society for Mass Spectrometry, 2002,药物色谱分析中不同方法的比例,1990年,2000年,LC/MS 法测定人血浆中克拉霉素的浓度,克拉霉素(clarithromycin) 红霉素衍生物 新一代对酸稳定的口服大环内酯类抗生素,以往克拉霉素血药浓度测定 多采用微生物法 HPLC紫外检测,克拉霉素,检测条件 流动相: 0.05%冰醋酸和乙腈（4060 v/v） 流速: 0.2mL/min 色谱柱: Shim-pack ODS 150mm2.0 mm I.D. 5m 柱温: 40 质谱离子化方式：电喷雾离子化（ESI） 离子极性:Positive； 选择性离子检测(SIM): 克拉霉素m/z: 748.5M+H+ 罗红霉素m/z: 837.5 M+H+ 内标物 14-羟基克拉霉素m/z: 764.5M+H+,血浆样品的处理 血浆样品, 内标罗红霉素, 碳酸钠溶液碱化后乙醚提取, 上清液用氮气吹干。最后残渣乙腈溶解。 方法的专属性 克拉霉素、内标、14-羟基克拉霉素的保留时间分别为1.93min、1.93min、1.92min,岛津自动前处理系统 （Co-Sense for BA LCMS ）,内容,自动前处理的优点与问题 自动前处理系统Co-Sense for BA的特长 采用新型色谱柱和稀释系统实现了高回收率 使用新型色谱柱的自动浓缩系统实现了高灵敏度 Co-Sense for BA + LCMS系统的特长,背景,样品前处理是目前分析化学的瓶颈，是分析化学研究的难点和热点问题之一。由于样品数量极多，且分析物含量越来越低、基体越来越复杂，迫切要求发展高通量、高选择性、高效率的在线样品前处理技术。因此，开展这方面的研究具有极为重要的意义。,HPLC/LC-MS广泛应用于血浆或血清的代谢物分析和原药分析，一般的血浆和血清分析，需要对样本进行预处理，以除去蛋白质，这样会降低精确度和工作效率。引入了具有限制性通路媒介（restricted access media -RAM）的预柱，可对血浆样本进行直接分析，而不必进行预处理。这样，可提高精确度、简化操作和提高工作效率 。但是，使用限制性通路媒介柱，也存在一些问题，需解决的问题：回收率、灵敏度、耐用性。,生物样品中的药物分析前处理的要点 除蛋白质 浓缩 手工前处理的问题 处理时间 重现性 药物回收率,前处理的现状,除蛋白、浓缩操作自动化的优点 提高分析精度 脱线处理时，难以保持操作完全一致，有时分析精度变差。 提高操作简便性 脱线处理时需操作熟练 提高处理效率 夜间可自动运行，大幅度地提高了处理效率 前处理自动化的课题 提高回收率及提高浓缩率,自动前处理的优点和课题,提高回收率的手段,有必要使与蛋白质结合的药物游离出来 与蛋白质结合的药物，在除蛋白质处理时，药物也与蛋白质一起被除去，药物回收率降低。 切断蛋白质结合（离子结合，疏水结合） 调整样品导入溶液的pH值 碱性药物时，使用pH值低的溶液 酸性药物时，使用pH值高的溶液 调整样品导入溶液的离子强度 20-100mM的缓冲液浓度 在样品导入溶液中添加有机溶剂 在20%以内使用有机溶剂（防止由蛋白质的变性而产生的析出） 使用界面活性剂 (*) 从药物保持（使用反相柱）的方式看，有抑制药离子化的pH 值较为理想。,方法,我们研究开发出优质的限制性通路媒介（RAM）预柱，应用柱切换HPLC系统及其在线稀释旁路系统，可对血浆直接进行药物分析。 我们的系统 .,回收率 即使是紧密与蛋白质结合的化合物，也能被预柱吸附（捕集）， 并且回收率几乎达到100% 灵敏度 目标化合物可进行浓缩和分离即使是大体积进样分析也如此。 不会造成峰值恶化。 耐用性 新设计的涂渍技术和粒径优化技术，使得数据保持稳定，即使是 长时间的实验也能如此。,Co-Sense for BA,何谓Co-Sense for BA 用于分析生物样品的应用系统 具有在线稀释旁通流路的自动前处理系统和新开发的前处理柱 Shim-Pack MAYl-ODS的组合，实现了真正的血浆（血清）的直接大量注入。 特长 可对应蛋白质结合率高的药物 使用样品导入用溶液的在线稀释的应用，即使是蛋白质结合率高的药物且在大量注入时 也可有效地捕集，回收率几乎100%。 超高速进样和无限接近零的交叉污染。 -使用高效自动进样器 迅速且有效地除去蛋白 有效地保护分析柱色谱柱和LC/MS的接口 经久耐用的新型柱 通过采用新开发的涂覆技术和粒子径的最优化，可得到长期稳定数据。,自动前处理系统的基本流路,自动前处理系统的基本流路,通过对样品导入溶液进行最优化，可提高回收率。 但是，为了提高浓缩效果而大量进样时的回收率会怎样呢？,血浆（血清）样品的大量进样时的回收率？,因大量进样，回收率降低。 通过安装在线稀释旁通流路，可大量注入血浆（血清）样品。 这便是Co-Sense的关键技术！,样品处理柱的容量,进样体积对色谱图的影响 当进样体积加大的时候，由于样品处理柱子容量的限制会发生峰展宽的现象.,100 uL,50 uL,10 uL,不同进样体积的影响,小体积进样的时候，预处理柱可捕集几乎所有的药物分子 大体积进样的时候，部分药物被蛋白带走，回收率降低,在线稀释泵提高回收率的原因,在样品进入预处理柱之前，在线稀释泵可预先将蛋白和药物分子分离,Shim-pack MAYI-ODS （RAM）预处理柱,采用Shim-pack MAYI-ODS除蛋白,将硅胶（50m）的外表面用亲水性聚合物涂覆，只将细孔内部用十八烷基进行化学修饰。象蛋白质这样的高分子不能进入细孔内部，并被外表面的亲水性聚合物阻挡，不在固定相上保留，很快地洗脱。另一方面，诸如药物这样的通常的小分子化合物则浸透到细孔内部，被保留在内部表面的固定相上。,column name ; Shim-pack MAYI-ODS packing material ; silica particle outer surface methyl cellulose inner surface octadecylsilyl group particle size ; 50mm column size ; 4.6mm i.d. x 10mm pH range ; 2 - 7.5 maximum pressure ; 20MPa,涂渍的甲基纤维素表面,药物,蛋白质,ODS 表面,预处理柱,Co-Sense for BA的流路构成,样品通过在线稀释旁通的作用 ，导入溶液自动稀释，被导入MAYI-ODS前处理柱。在除蛋白的同时，捕集、浓缩药物,Step1. 除蛋白质的捕集浓缩,分析用高压梯度泵,分析柱,自动进样器,前处理柱,在线稀释旁通,导入样品泵,检测器,被MAYI-ODS捕集的药物，经阀切换，导入分析柱,Step 2. 分析经浓缩的药物,导入样品泵,分析用高压梯度泵,分析柱,自动进样器,前处理柱,在线稀释旁通,检测器,在线自动稀释用旁通流路的效果,样品：消炎痛(1 mg/L) 添加血浆 样品导入液（稀释液）：0.1磷酸水溶液：乙腈=95：5 注入量：500L 稀释倍率：8倍 检测：UV 315nm,用蛋白结合率较高的消炎痛进行评价 无稀释旁通流路：回收率约50%。 有稀释旁通流路：回收率几乎100%,自动浓缩带来的高灵敏度,样品：消炎痛(1 mg/L) 添加血浆 无峰形歪斜 样品导入液（稀释液）： 0.1%磷酸水溶液：乙腈混合液（95：5） 检测：UV 315nm,实现高灵敏度,实现高灵敏度的大量注入的稳定性 捕集效率 即使注入血浆500L，回收率也几乎达到100%。 峰形状 样品名：添加消炎痛的血浆,流动相 (样品导入溶液) ：100mM 醋酸钠缓冲液 ,血浆样品中药物回收率测定,在线自动稀释用旁通流路的影响,各药物在有稀释旁路下的回收率结果 (spiked 2ug/mL each),Table. 血浆样品中药物回收率 (spiked 2ug/mL each, 50uLinj.),样品导入溶液 pH值变化对回收率的影响,样品导入溶液对回收率的影响 1,Table 血浆样品中各药物回收率结果 (spiked 0.5ug/mL each (Naproxen:2ug/mL), 50uLinj.),样品导入溶液对回收率的影响 2,样品导入溶液 离子强度变化对回收率的影响,Table Recovery of drugs in plasma (spiked 0.5ug/mL each (Naproxen:2ug/mL), 50uLinj.),样品导入溶液对回收率的影响 3,样品导入溶液 乙腈溶剂添加对回收率的影响,出色的柱使用寿命,连续注入时的稳定性 血浆基底的洗脱 从稳定的MAYL-ODS洗脱蛋白质等血浆基底 峰及回收率 稳定的峰形状及回收率（几乎100%）,样品 ：添加异丙基安替比林的血浆 注入量 ：100L 样品导入液 ：0.1%磷酸水溶液乙腈混合液 稀释倍数 ：8倍 检测 ：分析；275nm，血浆基质；280nm,Co-Sense for BA-LCMS系统的特长,通过在Co-Sense for BA系统上连接LCMS-2010EV，成为更强有力的生物样品分析系统 LCMS所具有的高选择性检测，在有复杂的基底的生物样品的分析中，发挥威力。,何种化合物可用 LC/MS分析?,取决于化合物的离子化效率； 化合物分子自身的极性，结构及其所含的功能基团等因素均会影响离子化情况； 多数具有一定极性的有机化合物可以通过ESI 或APCI的方式离子化，如: 药物及其代谢产物 天然产物 (生物碱, 配糖物、苷glycosides, taxanes, 毒素, 糖类, 脂类, 维生素等等) 蛋白质，多肽； 杀虫剂，除草剂 表面活性剂和染料,LC/MS的优势,强大的定性和选择性能力 多组份样品的准确定性； 未充分分离组份峰的鉴别； 消除杂质干扰； 可作为便捷的定性分析 用于合成和衍生反应的研究； 作NMR预分析的质谱鉴定； 广泛适用于难挥发性化合物的分析 扩展了大气压离子化的多种应用,对液相色谱分离组份进行强有力的定性确证,TIC色谱图 质谱图,强大的选择性,未充分分离峰的鉴别,椰子油的分析,2.5,5.0,7.5,10.0,12.5,15.0,17.5,min,0e6,10e6,20e6,30e6,40e6,50e6,60e6,Int.,m/z 467.5 : C40 DB=1,m/z 495.5 : C42 DB=2,m/z 523.5 : C44 DB=3,TIC,高效液相色谱HPLC与质谱MS的接口技术研究始于1970s ; 大气压下的离子化API (atmospheric pressure ionization) 于1987年商品化。 大气压下的离子化接口: 电喷雾离子化 Electrospray ionization (ESI)；大气压下化学离子化 Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) ；大气压下光离子化Atmospheric Pressure Photo Ionization (APPI),LC/MS离子化接口,高效液相HPLC,质谱MS,离子化接口,含缓冲盐的水/有机相； 非挥发性的流动相Non-volatile,高真空状态 分析离子（m/z）,大气压状态,低真空区域,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,机械泵 涡沦分子泵TMP1 涡沦分子泵TMP2,MS质量分析器,高真空区域,LC/MS系统硬件主要构造,离子源,离子化接口,大气压下的离子化API方法的优势,电喷雾Electrospray(ESI) 适于极性样品的分析； 推荐使用半微量流速，在雾化气条件下LC可实现高至 1ml/min的流速； 用该种离子源能形成多电荷离子，扩展了所能检测的分子量范围； 大气压下化学电离Atmospheric Pressure Chemical Ionization(APCI) 低极性化合物； 推荐使用半微量流速，在雾化气条件下LC流速可实现高至2ml/min； 比热喷雾具有更好的稳定性； 大气压下光电离Atmospheric Pressure Photo Ionization(APPI) 弱极性和非极性化合物 直接APPI离子化及掺杂物APPI离子化方式的正确选择,LCMS2010EV仪器结构特点,- 干燥气体 - 保护,TMP 1,TMP 2,旋转泵,废液管,检测器,四极杆,前杆,入口镜,聚焦镜,八极,Q-阵列,Skimmer,保护阀,来自LC,雾化气体,ESI或APCI或APPI源,CDL,干燥气体,岛津QoQ设计,允许流速：0.0011 ml/min； 操作温度：室温； 雾化气流速N2 ：1.5 L/min,高电压,雾化气,大气压下的离子化(API) 原理 电喷雾离子化 ESI,ESI,液相流出组份,1)带电液滴,2)溶剂蒸发,3)离子蒸发,大气压下的离子化 (API)原理 大气压下化学离子化 (APCI),高压放电针,离子-分子反应,允许流速：0.05 2 ml/min 加热模块: 400oC 雾化气流速N2 ： 2.5 L/min,APCI,液相流出组份,雾化气,大气压下的离子化 大气压下化学离子化 (APCI),LC 流份在雾化气作用下进入加热模块； 流动相蒸发； 高压放电条件下，质子化溶剂被离子化 (产生反应离子)； 4) 样品和已产生的反应离子发生离子-分子反应生成质子化分子,离子-分子反应,Schematic diagram of APPI,ESI,APCI,APPI,polarity,Very polar,nonpolar,Molecular Weight,10,000,1,000,100,正离子或负离子模式采集数据?,质谱数据以正离子还是负离子模式采集，需考虑被测样品结构和特性等 由于C-O、C-N、双键、三键及碱性化合物具有较强的质子亲和力，上述基团或化合物更倾向于形成正离子； 含COOH, -F, -Cl, -HSO3 的偏酸性化合物由于具有较强的质子给予能力，更倾向于形成负离子； 还有许多化合物既可形成正离子，也能生成负离子；,LC/MS 2010EV的硬件结构,正交设计的离子源,加热的毛细管,Q-array,八极杆 Octapole,四极杆质量分析器,检测器,离子转移,质量过滤,CDL(Curved Desolvation Line )单元和QoQ系统,QoQ系统是一套包含Q- 阵列(Q-array) + 八极杆透镜(Qctopole lens) +四极杆(Quadrupole)。 这套离子光学系统是岛津公司集30年质谱设计、生产经验的结果，具有优异的离子传输和离子会聚性能 。,QoQ 系统介绍,Q-array（Q-阵列） 三排四极板平行排列，形成一锥形区域，使离子能被有效地引入八极杆。,Octopole Lens（八极杆透镜） 八极杆透镜实现稳定的离子会聚, 不易受系统真空变化的影响。,Quadrupole（四极杆） 带有预杆的钼制双曲线四极杆系统作为 质量过滤器。预杆保护主四极杆免受污染，并延长使用寿命。岛津公司多年来 不断改进、优化四极杆系统的性能, 最终实现优异的离子传输效率，质量数的稳定性和峰形。,Q,Q,O,Q-array中离子轨道示意图,上图显示具有不同入射角度的离子集穿过Q-array的轨迹。离子的运行路线被校正后，汇聚在中心的Skimmer入口处。这一离子运行轨道是依据Optdesign模型（岛津研发中心）计算优化得到的。,各种方向运动矢 量的离子集,通过Q-array后的离子集，经会聚作用具有同一矢量,三排四极板成锥形平行排列， 使离子被会聚于一狭窄区域。 这与具有高频电压的四极杆工作原理类似。锥形设计提高了离子会聚能力，这也是提高灵敏度的关键。 Performance of the Q-array and related optics is up to 10 times more sensitive than other designs.,典型的LC/MS质谱图,404,341,497,66,82,469,453,57,482,APCI 正离子模式,APCI 负离子模式,Co-Sense for BA-LCMS分析血浆样品,通过在Co-Sense for BA系统上连接LCMS-2010EV，成为更强有力的生物样品分析系统 LCMS所具有的高选择性检测，在有复杂的基底的生物样品的分析中，发挥威力。,分析条件,SIM chromatograms of standards,each 1ug/mL, 5uL,重现性,标准 血浆中的药物,倍他乐克 95.0% 普萘洛尔 97.4% 利多卡因 94.0% 狄布卡因 107.7% 布比卡因 97.1% each 1ug/mL, 5uL, n=5,回收率,1 :倍他乐克 r=0.99954 2 :普萘洛尔 r=0.99958 3 :利多卡因 r=0.99981 4 :狄布卡因 r=0.99978 5 :布比卡因 r=0.99986 0.01 1ug/mL, 10uL, n=5, plasma spiked,1,2,3,4,5,校正曲线,提取液中含乙腈对回收率的影响,a. 提取液 : 10mM 乙酸铵/乙腈 = 95/5 b. 提取液 : 10mM 醋酸铵,耐用性 (Chromatogram),0.1mg/mL each, plasma spiked, Injection volume : 50mL, Extraction time : 2min,Column pressure at star