接骨合剂在同种异体骨修复骨缺损过程中BMP2基因的表达.doc

接骨合剂在同种异体骨修复骨缺损过程中BMP-2基因的表达 作者：李林，杨玉宝，李成福，金日，金元哲【摘要】 目的探讨同种异体骨修复骨缺损过程中骨形态发生蛋白(BMP-2)的表达及接骨合剂的干预作用。方法采用新西兰大白兔30只，制成左右桡骨为1.5 cm的骨缺损模型，左右侧桡骨骨缺损处用同种异体髂骨骨松质制成颗粒状植骨分成两组：一组用接骨合剂饲养，另一组用普通饲料饲养，于手术后1，2，4，6，8周处死动物取材，标本进行HE、免疫组化及原位杂交染色。结果实验组和对照组在1周时，实验组和对照组的BMP-2表达呈弱阳性，实验组4周时表达呈强阳性， 6，8周时表达呈阳性，对照组4周时表达呈阳性， 2，6，8周时表达呈弱阳性。结论接骨合剂对同种异体骨修复骨缺损有明显的促进作用。 【关键词】 接骨合剂 骨缺损 骨形态发生蛋白随着社会的快速发展，交通工具的日益增多，导致车祸越来越多，致使开放性骨折、骨坏死、骨缺损患者增多。骨折不愈合及骨缺损始终是临床上的治疗难点，治疗方法较多。中医药治疗骨折已有数千年的历史，过去主要是通过临床疗效观察其药效。中药治疗骨折的机理主要有改善血液循环，促进血肿的吸收和机化，提高骨痂的质量，促进胶原的形成和促进细胞的活性等1。本实验采用接骨合剂混合常规饲料喂养同种异体移植的骨缺损模型，观察其对骨缺损模型中的骨痂中BMP的表达量及对骨修复的促进作用。1 材料与方法1.1 接骨合剂饲料的配制100 kg普通饲料加骨碎补250 g，续断250 g，自然铜400 g，土鳖虫100 g。1.2 试剂BMP多克隆抗体，北京军区总医院提供；SP 试剂盒，北京中山技术有限公司提供；BMP-2原位杂交试剂盒，武汉博士德公司提供；DAB显色系统，北京中山技术有限公司提供；DFPC水，北京华美技术有限公司提供。1.3 动物新西兰大白兔，体重2.0 2.5 kg，雌雄不限，延边大学医学部动物实验室提供。1.4 动物模型及标本的制备大白兔30只，常规手术方法，制成左右桡骨为1.5 cm的骨缺损模型，左右侧桡骨骨缺损处用同种异体髂骨骨松质制成颗粒植骨分成两组：一组用接骨合剂饲料喂养，一组用普通饲料饲养，术后按每kg体重15万u青霉素，连续肌肉注射3 d。手术1，2，4，6，8周处死动物取材。用Bouin液在常温情况下固定24 h，用15%EDTA溶液于常温环境下脱钙每周更换EDTA溶液1次，待能用大头针可刺入骨皮质时，脱钙终止后，用流水冲洗标本过夜，酒精梯度脱水，石蜡包埋标本，制备4 m切片，HE、免疫组化染色。结果判定：阳性为棕色，在细胞浆中出现棕黄色为阳性，按颜色深浅将反应分成4级，无染色为阴性，浅黄色为弱阳性，棕黄色为阳性，棕黑色为强阳性。1.5 原位杂交探针的标记及原位杂交的反应程序，按地高辛试剂盒说明书进行，探针序列为：1）5 -CCGTC TTCTA GCGTT GCTGC TTCCC GAGGT-3 2）5 -TTTCC ATCAC CGAAT TAATA TTTAT GAAAT-3 3）5 -TCAAG CCAAA ACAGC GGAAA CGCCC-3，切片经脱蜡至水后，用3%的过氧化氢封闭内源酶 ，胃蛋白酶消化暴露mRAN 核酸片段，4%多聚甲醛固定10 min，用DEPC 双蒸水洗涤处理后，加预杂交液4 h（40），杂交15 h（40），依次经2XSSC ，0.5XSSC，0.2XSSC 溶液充分洗涤，加地高辛抗体（37）1 h，苏木素复染，酒精梯度脱水，二甲苯透明封片。2 结果2.1 HE染色实验组1周时移植骨内有部分骨细胞坏死，部分细胞核浓缩，甚至消失，血肿内并伴有炎性细胞生成，2周时骨基质长入移植骨内并有少量软骨细胞形成并伴有大量血管生长，并有核浓缩碎裂现象，48周长骨植骨区的血管数量增多，有明显网状新骨生成。对照组1周缺损区有大量的炎性反应伴有许多骨吸收，2周后有许多软骨细胞的生成，4周软骨细胞的生成增多伴有少量钙化，68周骨细胞钙化进一步增加。2.2 免疫组化染色实验组1周时，骨端的骨细胞，骨痂中的骨细胞及软骨细胞染色成弱阳性表达。2周时，骨端的骨细胞，骨痂骨细胞及软骨细胞染色成阳性表达，4周时，骨痂中骨细胞，骨痂表面成骨细胞成强阳性表达，68周， 骨痂中骨细胞，成骨细胞呈阳性染色。对照组1周BMP染色同对照组无明显区别，不同的是对照组2 ，4，6 ，8周染色一直呈弱阳性表达。2.3 原位杂交1周时，实验组或对照组新生骨基质和成软骨细胞中几乎无BMP-2的表达；24周，特别是在4周左右新生骨基质、成骨细胞在原位杂交中显示，含有丰富的BMP-2，特别在实验组中表达呈强阳性；68周实验组或对照组BMP在成骨细胞和间充质细胞呈阳性表达。结果提示BMP-2在喂养接骨合剂饲料的骨缺损模型中，对新骨的形成和发展有重要影响，使BMP-2表达量增强血管数量增加明显，加快骨缺损的修复过程。3 讨 论Urist2在20世纪60年代提取BMP并提出了BMP的骨诱导理论。BMP是近年来研究较多的骨生长因子之一，有较强的骨诱导能力，人工重组rhBMP-2可以促进骨折的愈合，尤其是克隆化的BMP-2，BMP-7生物用活性较强3。本实验以兔桡骨骨折模型模拟正常骨缺损，用同种异体髂骨骨松质制成颗粒状植骨植修复长段骨缺损，用活血化淤、补肾益胃的骨碎补、续断、自然铜中药对骨缺损模型进行实验。通过HE染色，免疫组化染色和原位杂交的方法观察了骨缺损的修复时间与BMP-2的表达关系。上述实验结果表明，早中期有大量毛细血管形成，并伴有移植骨的吸收和许多软骨细胞的形成，中晚期大量软骨内化骨形成，骨组织并进一步得到改建，一些软骨细胞也已经钙化，骨髓腔已初步形成。BMP-2在实验组中的表达比对照组中的表达强，这可能由接骨合剂在植骨后BMP-2在局部的浓度刺激局部的毛细血管生成和促进骨的转化过程。BMP-2在喂养接骨合剂饲料的骨缺损模型中，对新骨的形成和发展有重要影响，使BMP-2表达量增强血管数量增加明显，加快骨缺损的修复过程。本研究只是从一个方面探讨了用同种异体髂骨骨松质制成颗粒状植骨修复长段骨缺损的机制，而实际准确地揭示这一机理有待于在分子生物学方面进一步研究和探讨。【参考文献】 1夏志道，房世源，常超英，等.壮骨素促进骨折愈