新生鼠脑组织缺氧缺血再灌注损伤NFκB的表达及意义.doc

新生鼠脑组织缺氧缺血再灌注损伤NFB的表达及意义 作者：张定荣张海鸿 车芬芳徐书珍 【摘要】 目的 观察新生鼠窒息后缺氧缺血再灌注损伤不同时间脑组织NFB动态变化，以探讨NFB信号途径在新生儿窒息脑损伤中的作用。方法 出生7 d新生鼠随机分为对照组(A组)和窒息组(B组);制备新生鼠窒息模型，并于窒息后1、3、5和7 d取脑组织行石蜡切片。采用免疫组织化学方法检测窒息新生鼠脑组织NFB p65活性表达水平，用苏木精伊红染色观察窒息后脑组织形态学变化。结果 B组脑组织NFB的表达较A组显著增强(P<0.05),以5 d时升高最明显;并伴有神经细胞坏死及凋亡现象。结论 NFB可能通过炎症反应机制介导窒息脑损伤过程。 【关键词】 NFB;窒息;新生鼠;缺氧缺血再灌注损伤; 脑组织 【Abstract】 Objective To observe the activation of NFB in hypoxia ischemia reperfusion brain injury of newborn rats with asphyxia. The aim of study is to explore the effect of NFB signal pathway on brain injury of newborn with asphyxia, so as to provide the experimental base for finding clinical treatment of asphyxia,in which NFB is taken as the target.Methods newborn rats(7 days old)were randomly divided into control group (A) and asphyxia group (B).The model of asphyxia was induced in B group .Immunohistochemical method was used to detect the activity of NFB P65 in the brain of the newborn rats,and hematoxylineosin staining was perform ed to observe the histological evidence of asphyxia in the brain.Results The activity of NFB P65 was higher in group B than that in group A(P<0.05),increased to the highest peak at 5 d,with nerve cell death and apoptosis in group B.Conclusion The NFB,may play an important role in brain injury with asphyxia. 【Key words】 NFB，asphyxia, newborn rats, hypoxia ischemia reperfusion, brain tissue 脑组织中的NFB能被许多因素激活，其中包括窒息后脑组织缺氧缺血再灌注损伤。近年来的研究发现NFB还存在于脑血管内皮细胞、神经细胞和胶质细胞中，在调节炎症反应的基因中起关键作用，与脑缺血及再灌注损伤时的炎症机制密切相关1。本实验建立新生鼠窒息动物模型，旨在探讨NFB信号途径在新生鼠窒息中的作用，为进一步治疗新生儿窒息提供新的思路。 1 材料与方法 1.1 实验动物及分组 七日龄Wistar大鼠25只，由青岛市市立医院动物中心提供，雌雄不限，体重1220 g。按同窝随机分成两组：对照组5只(A组)，窒息组(B组)20只，窒息组又分为4个亚组(Ba、Bb、Bc、Bd)，即分别于窒息后1、3、5和7d处死动物，每个时相点各5只。各组间体重无显著性差异(P>0.05)。 1.2 动物模型的建立 窒息动物模型：为更接近新生儿窒息病理过程(缺氧缺血再灌注损伤)，根据新生鼠常压窒息模型2，将实验动物分别置于容积为55 ml的缺氧瓶(即磨口瓶，保证密闭性)中，内装0.005 kg钠石灰，待动物安静后，塞紧瓶塞,密闭30 min后，立即氧罩吸氧2 h(氧浓度50%60%)，之后放回笼中，仍由母鼠哺乳喂养。对照组动物模型：模拟上述过程不塞紧瓶塞，仍由母鼠哺乳喂养。 1.3 方法 1.3.1 标本采集：分别于窒息后1、3、5和7d迅速横断各组新生鼠脊髓，在冰盘上快速取全脑组织，以冰生理盐水清洗至无血迹，切取含有海马组织的脑片，所有标本均经10%的中性福尔马林固定，经5860石蜡包埋后，连续切片2张，厚度为4 m，烤片30 min，供免疫组化和病理检查用。 1.3.2 新生鼠脑组织NFB p65蛋白活性检测：采用免疫组化法，标本测定一次完成。测定步骤：组织切片;3%H2O2去离子水孵育;蒸馏水冲洗;80%火力微波修复;PBS洗3次;滴加正常山羊血清封闭液;滴加适当稀释的一抗;PBS振洗3次;滴加生物素化二抗工作液;PBS振洗3次;滴加三抗SA/HRP;PBS振洗3次;DAB显色;苏木素复染细胞核;梯度酒精脱水，中性树胶封片。免疫组化同时加作阴性对照片(PBS代替一抗)。 1.3.3 脑组织形态学检查:苏木精伊红(HE)染色用于观察脑组织形态学改变，脑细胞损伤情况，帮助判断坏死和凋亡细胞。 1.4 统计学处理 所得数据以均数标准差(xs)表示，采用SPSS11.0统计软件进行统计学处理，进行多因素方差分析，两组间比较用t检验，P<0.05差异有统计学意义。 2 结果 2.1 NFB p65结果判断 阳性细胞为细胞核染成棕黄色或有棕黄色颗粒沉积，定位于细胞核和细胞浆。由二位病理医生按双盲法对免疫组化结果进行评估，即在高倍镜下(200)随机观察10个视野,计数1 000个细胞中的阳性细胞数，计算出阳性细胞百分率，免疫组化染色图片见图1、2。 2.2 脑组织病理学判断 参照图谱1，正常神经细胞结构：锥体细胞呈椭圆型，核染色质疏松，核仁清楚;神经细胞损伤：胞体缩小，呈三角形或长条形，胞核固缩深染，核仁消失，细胞与周围间隙增宽。 2.3 神经症状评分 从缺氧开始观察24 h，观察异常神经症状并进行评分。评分标准4:竖毛震颤，运动减少各计1分;瘫痪、旋转、抽搐各计3分;昏迷计6分。结果见表1。A组无神经系统症状，而B组出现明显神经系统症状(P<0.05)，B组各亚组与A组相比均有显著性差异(P<0.05)，以Bb及Bc组最显著，Bd组趋于稳定，随时间延长，在一定时间后神经症状可能逐渐好转，但未作进一步观察。 表1 各组异常神经症状评分 (xs,n=25) 组别 n 异常神经症状评分 t值 P A 5 0 Ba 5 6.401.51 9.657 <0.05Bb 5 8,421.32 8.625 <0.05Bc 5 9.842.10 12.624 <0.05Bd 5 8.241.63 10.032 <0.05 2.4 病理检查 A组:外观及病理检查均正常。B组:肉眼观察脑表面苍白，切面上可见水肿，偶见点状出血。HE染色光镜下见各亚组不同程度组织形态学改变，见炎细胞浸润，细胞水肿,变性，及坏死现象;细胞皱缩，细胞核固缩，胞浆疏松，结构不清等凋亡改变。 2.5 脑组织NFB p65蛋白活性表达(见表2) A组:活性表达为6.001.58。B组:各时相点与对照组比较活性均有增加(P<0.05)，见表2。实验1 d即增高，实验第5天升高最明显，为A组的56倍，7 d已开始降低;不同时间点之间除3 d组和5 d组之间无统计学意义外，其他各时相点之间均有显著性差异(P<0.05)。表2 A组与B组NFB p65阳性细胞比较 2.6 脑组织NFB p65蛋白活性表达与病理改变之间的关系 NFB p65蛋白活性与病理改变不一致，NFB p65蛋白活性在Ba、Bb、Bc呈逐渐增加，Ba、Bb组细胞坏死现象明显，Bc、Bd组细胞凋亡现象逐渐明显。Bd组NFB p65蛋白活性已开始下降，神经细胞凋亡现象也趋于稳定。 3 讨论 核因子B(nuclear factor kappa B,NFB)是一种重要的转录因子，存在于真核细胞中，具有广泛的生物活性，激活后可促进许多细胞因子、黏附分子等基因的转录，在机体的免疫应答、炎症反应和细胞的生长发育等方面发挥着重要作用 4。在窒息所造成的缺氧、缺血过程中，恢复血流可避免细胞死亡和组织损伤，但在长时间严重缺氧、缺血基础上，恢复血流会引起更剧烈的损伤，即再灌注损伤。本研究表明，新生鼠窒息30 min，复氧1、3、5和7 d四个时相点，NFB的活性均明显增高，说明在窒息新生鼠脑组织存在NFB激活。Stephenson等5用凝胶电泳迁移分析试验发现脑缺血再灌注0.5 h后NFB的活性即明显升高，6 h达到高峰，24 h降到1 h的水平。本实验表明NFB在窒息复氧后1 d即明显升高，5 d时达高峰，以后逐渐下降，但7 d时仍明显高于对照组。造成两者试验结果有差异的原因可能与动物模型不同，缺氧缺血时间不同，引起的缺血程度以及再灌注时间与程度不同有关。本研究发现NFB与神经细胞损害病理改变密切相关，随着NFB的升高神经细胞损害,坏死及凋亡现象明显，早期以细胞坏死为主，后期则已调亡为主。7 d时NFB开始下降，病理改变也趋于稳定好转。说明NFB参与了这一病理损害过程,NFB的激活可能对病理改变的控制和恢复有促进作用。 NFB在神经系统中广泛表达，细胞受到外界刺激，如：炎症、创伤、缺血再灌注等损伤后NFB激活，在脑缺血再灌注损伤中NFB可被许多因子激活，包括炎症细胞因子TNF、IL1、氧自由基和细胞内钙增加等6。 本试验证明窒息新生鼠海马区凋亡增加，且伴随着NFB活化表达的增高，提示窒息后NFB的激活与细胞凋亡有关。Schneider等7为了研究NFB在神经元死亡中的作用，观察了啮齿动物卒中模型的NFB的活性，发现在缺血半球NFB被激活的p50敲除鼠，缺血损害显著减轻。缺血缺氧后神经细胞的死亡主要分为早期的坏死和继发性细胞凋亡，本研究Ba、Bb组以坏死为主，Bc、Bd组以调亡为主也证明了这一点。NFB的活化对阻止细胞凋亡，改善病理变化的有力的炎性机制反应。缺血缺氧损伤后机体通过抗损伤机制在一定程度上诱导NFB的活化来对抗损伤，随着损伤的稳定好转NFB也由于刺激减弱而活性降低。 新生儿窒息可导致新生儿脑缺氧缺血损伤，病死率和后遗症率高，是新生儿期造成伤残儿童的主要原因之一。据此推测NFB的活化与新生儿窒息后脑损害相关，NFB的活性可能对避免或减轻窒息后脑损害有治疗作用。 【参考文献】 1 Nolan B,Collette H,Baker S,et al.Inhibition of neutrophil apoptosis after severe trauma is NF kappa beta dependentJ.J Trauma,2000,48(4):599604. 2 董文斌，冉隆瑞，冯志强，等.生脉注射液对窒息后脑损伤保护作用的研究J.中华儿童保健杂志，1998,6(1):3234. 3 Barnes PJ,Karin M.Nuclear factor NFB pivotal transcription factor in chronic inflammatory diseaseJ.N Engl J Med,1997,17:39. 4 Seegers H, Grillon E, Trioullier Y,et al.Nuclear factor kappa B activation in permanent intraluminal focal cerebral ischemiaJ.Cere Blood Flow Metab,2000,20(3):592594. 5 Stephenson D, Yin T, Smalstig EB,et al.Transcription factor Nuclear Factor kappa B is activated in neurons after focal cerebral ischemiaJ.Cere Blood flow Metab,2000,20(3):592603. 6 Rroll JE,Howard EF,Hess DC,et al.N