活化蛋白1在膳食牛磺酸防护视网膜光损伤中的表达变化.doc

活化蛋白-1在膳食牛磺酸防护视网膜光损伤中的表达变化【摘要】 探讨膳食牛磺酸防护视网膜光化学损伤的分子机制。方法 30只Sprague-Dawley大鼠饲以AIN-93标准饲料或补充4牛磺酸膳食干预15 d，给予（3 000200）lux的持续光照24 h，形态测量法观察视网膜外核层厚度，电生理法检测视网膜功能，Western blot或免疫组织化学法检测活化蛋白-1（actor protein-1，AP-1）亚单位c-fos/c-jun蛋白表达，荧光定量PCR法检测其mRNA表达。结果 光照能降低视网膜外核层厚度，降低视网膜电图a波和b波的幅度，升高AP-1蛋白和mRNA的表达，4%膳食牛磺酸在转录和翻译水平下调AP-1的表达，有效防护视网膜光化学损伤。结论 转录因子AP-1在膳食牛磺酸防护视网膜光损伤中发挥着重要作用。 【关键词】 活化蛋白-1 牛磺酸 视网膜 光损伤 Abstract：Objective To investigate the underlying molecular mechanism involving in dietary taurine protecting retina from photochemical damage.Methods Thirty Sprague-Dawley rats fed with or without 4% taurine under AIN-93 diet for 15 d were persistently exposed to fluorescent light(3000200 lux) for 0-24h.The thickness of outer nuclear layer(ONL)of retinas was measured with morphometry.The retinal function was detected with electrophysiological technique.The expression of actor protein-1(AP-1)subunits c-fos/c-jun protein was analyzed with Western blot or immunohistochemical method,and their mRNA expression determined with quantitative real-time PCR(qRT-PCR).Results There was a decrease in thickness of ONL, and in amplitude of a- and b- waves of electroretinogram,an increase in protein and mRNA expression of c-fos/c-jun subunits in retinas of rats exposed to light.4% dietary taurine effectively prevented retinal photochemical damage as changes of morphology and electroretinogram(ERG).Also,the supplementation caused a down-regulation in expression of c-fos/c-jun subunits.Conclusions Transcription factor AP-1 plays a pivotal role in dietary taurine protecting retina from photochemical damage. Key words:actor protein-1;taurine;retina;light damage 视网膜光化学损伤是视网膜光损伤最主要的一种形式，其早期病理表现为视网膜功能减退，视网膜内外节段排列紊乱甚至断裂消失，感光细胞变性丢失，外核层（Outer nuclear layer，ONL）厚度变薄，后期病理表现为视网膜感光细胞凋亡性坏死，视觉功能严重受损甚至失明1。针对视网膜光化学损伤的各致伤环节，现已发现钙通道阻滞剂、地塞米松、天然抗氧化剂、自由基清除剂，以及神经营养因子等对光化学损伤有一定的保护作用，然而这种防护作用的效果并不理想2。牛磺酸（Taurine）是体内一种游离的条件必需氨基酸，在视网膜尤其是感光细胞和Muller细胞内含量极为丰富，在视网膜生长发育、维持正常视功能等方面发挥着重要的作用。作者以往研究发现牛磺酸作为强抗氧化剂，能降低视网膜光损伤中的丙二醛含量，同时升高超氧化物歧化酶、谷胱苷肽还原酶的活性，阻止视网膜感光细胞的凋亡，但这种抗凋亡效应的分子机制还不清楚3,4，有研究显示视网膜光损伤中转录因子AP-1的表达上调5。本研究以Sprague-Dawley大鼠光化学损伤为实验模型，观察AP-1亚单位c-fos/c-jun在膳食牛磺酸防护视网膜光损伤中的表达变化，以探讨牛磺酸防护视网膜光化学损伤的具体分子机制。 1 材料和方法 1.1 主要试剂和仪器 牛磺酸购于北京世纪维他生物技术有限公司；GENMED蛋白质西方杂交印迹试剂盒（Cat.GMS30005.2）购自上海杰美基因医药科技有限公司；兔抗大鼠c-fos、c-jun单克隆抗体、SP 试剂盒羊抗兔IgG(SP9001)、DAB试剂盒购于中杉生物制品有限公司；SYD-I型多功能光照控制箱和SYD-型暗适应箱：本研究组与西南师范大学物理学院联合研制；光学显微镜：Olympus BX51型，日本；视觉电生理刺激仪：AVES8000型，国产；电转移装置：Bio-rad公司，美国；核酸蛋白检测仪：Eppendorf公司，美国凝胶成像系统：DC290，美国。 1.2 动物及分组 30只清洁级Spregue-Dawley大鼠由第三军医大学第三附属医院动物中心提供，体重（15020）g，雌雄不拘。随机分为以下三组，每组10只：正常对照组 饲以AIN-93标准饲料；光照组 饲以AIN-93标准饲料，（3 000200）lux持续光照24 h；牛磺酸组 AIN-93标准饲料中添加4牛磺酸15 d后，（3 000200）lux持续光照24 h。实验动物经处理后，检测视网膜电图（ERG），乙醚麻醉断头处死，一只眼用于测量外核层厚度，另一只眼用于检测AP-1亚单位c-fos/c-jun蛋白或mRNA表达。 1.3 视网膜形态学观察 参照文献6。去除眼球外周结缔组织，在眼球三点钟位置留下少量结缔组织并保留视神经以标记眼球方位。10的中性甲醛固定，常规石蜡包埋，经视神经矢状纵切眼球，作5 m厚切片，选取视神经乳头（Optic nerve head，ONH）旁颞侧组织行苏木精伊红染色后，光镜下观察视网膜各层结构变化，并采用Bio-Rad图像分析系统测定各组视网膜外核层厚度。 1.4 视网膜电图检测 大鼠经暗适应24 h后， AVES-8000型视觉电生理刺激仪记录暗适应视网膜电图（ERG）。甲基纤维素角膜表面麻醉，速眠新注射液腹腔内注射（1.0 ml/Kg体重）麻醉，托吡胩胺散瞳20 min.记录电极为环形金电极，置于大鼠眼角膜缘；参考电极和接地电极为不锈钢针，分别置于记录眼同侧内眦部以及额正中皮下。采用单次闪光刺激，刺激光强为2.00 cdsm-2，叠加5次，每次间隔2 min，通频带为1300 Hz，记录ERG的a波、b波振幅以及潜伏时间。 1.5 免疫组织化学法检测c-fos蛋白表达 按照免疫组化染色试剂盒说明书进行。石蜡切片梯度酒精脱蜡水化，3H2O2孵育510 min，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min，0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液微波修复抗原20 min，正常血清封闭液10 min，兔抗大鼠c-fos单克隆抗体以1100稀释（阴性对照用PBS代替），37 2 h，PBS漂洗3 min3，生物素标记二抗工作液，37 10 min，PBS漂洗3 min3，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 10min，PBS漂洗3 min3，最后3，3二氨基联苯胺（DAB）显色510 min，封片并照相。 1.6 Western blot检测c-jun蛋白表达 按照蛋白质西方杂交印迹试剂盒说明书进行。常规方法提取视网膜总蛋白，经Lowry法定量后，取40 g总蛋白进行凝胶电泳并转移至聚偏(二)氟乙烯膜上，1%牛血清白蛋白封闭，1400 c-jun单抗4过夜，140生物素化二抗工作液室温振摇1 h，140稀释辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素三抗工作液室温振摇1 h，DAB显色，Bio-Rad图像分析系统扫描各条带的灰度值。 1.7 荧光定量PCR法检测c-fos/c-jun mRNA表达 采用TRIZol试剂盒提取各组视网膜总RNA，取4l RNA模板做逆转录成cDNA。Primer Express software 2.0 (PE Biosystems)软件设计c-fos/c-jun寡核苷酸引物和TaqMan探针。内参-actin：正义链 5-GCG CGG CTA CAG CTT CA-3，反义链5-TCT CCT TAA TGT CAC GCA CGA T-3，探针序列5- FAM-CAC CAC GGC CGA GCG GGA-TAMRA -3；c-fos：正义链5- GGA GGT CTG CCT GAG GCT TC -3，反义链5- CAC GTT GCT GAT GCT CTT GAC -3，探针序列5-FAM- CAA CGA CCC TGA GCC CAA GCC AT -TAMRA-3;c-jun：正义链5- GAC GGA CCG TTC TAT GAC TGC -3，反义链5- GGA GGA ACG AGG CGT TGA -3，探针序列5-FAM- TGG AAA CGA CCT TCT ACG ACG ATG CC -TAMRA-3。所有引物由上海生工公司合成。利用ABI Prism 7000 TaqMan 实时荧光热循环仪(PerkinElmer Life Sciences)检测c-fos/c-jun的mRNA表达量。热循环参数：93 2min, 93 1min,55 1min，70 30s，40个循环。c-fos/c-jun mRNA的相对表达量为与-actin的拷贝数之比。 1.8 统计分析 所有数据用Stat-Light软件（Yukmus Co.,Tokyo, Japan）进行统计学处理，结果用s表示。三组间视网膜电图和ONL厚度先用单因素方差分析（ANOVA）检验其差异性，然后采用Ryans 法进行多组间比较。光照组和牛磺酸处理组间c-fos/c-jun mRNA和蛋白的表达量用Students t检验。所有显著性水平设定为P0.05. 2 结果 2.1 外核层厚度（图1） 对照组、光照组和牛磺酸组视网膜外核层的平均厚度分别为（33.58.3）,（18.86.7）和（29.67.4）m.光照导致视网膜厚度在对照组减少了47.1%，在牛磺酸组减少了16.7%，且视网膜厚度在牛磺酸组与光照组间有显著性差异（P0.05），而牛磺酸组与对照组相比无显著差异（P0.05）。 2.2 视网膜功能（表1） 视网膜经光照后，a波和b波的波型不典型，波幅降低，甚至熄灭，潜伏期延长。而牛磺酸干预组具有典型的a波和b波，与光照组相比，a波、b波幅值增加（P=0.016），潜伏期减少（P=0.015）；与对照组相比，除a波幅值降低外（P=0.03），其它指标无显著性差异（P=0.41）。表1 膳食牛磺酸改善光照视网膜功能 2.3 c-fos表达（图2） 免疫组化结果显示，对照组视网膜c-fos抗体染色在内核层（INL）有散在阳性细胞分布，ONL偶见阳性细胞；光照组INL中阳性细胞染色加深，而ONL中阳性细胞在光照早期随光照时间增多，后期未观察到阳性细胞；牛磺酸组光照后INL阳性细胞也增多，而ONL阳性细胞较少（图2A）。qRT-PCR结果显示，c-fos mRNA的表达在对照组较低，在光照1h呈应激性增高（P=0.017），牛磺酸组在光照1h c-fos mRNA表达也显著低于光照组（P0.01）（图2B），该结果与免疫组化结果相符，提示牛磺酸能在转录和翻译水平下调c-fos表达。 2.4 c-jun表达（图3） Western blot结果显示，光照组视网膜c-Jun蛋白表达，与对照组相比，6 h开始增高，9 h达到高峰，其后表达量仍然维持较高水平，牛磺酸组c-Jun蛋白表达在9、12、24 h蛋白表达相对量低于对照组（0.05）；且在整个光照期间都低于光照组(P0.05)（图3A）。视网膜c-jun mRNA表达在光照3 h开始增高，6 h达到高峰，12 h仍然有较高表达，而在牛磺酸组光照6 h后显著低于光照组的相应时相点（0.05）（图3B）。 3 讨论 作者前阶段研究证实，膳食补充牛磺酸能通过其抗氧化作用而有效防护视网膜的光化学损伤3,4。本研究发现，牛磺酸能阻止光照过程中视网膜外核层厚度的降低（图1），改善视网膜电图（表1），提示通过膳食干预的途径，添加牛磺酸能保护光感受细胞的丢失或溃变，从而维护视网膜功能的完整性。这些结果进一步证实牛磺酸在视网膜发育、以及维持视网膜功能和结构的完整性方面发挥着重要作用7。 视网膜光照后，感光细胞丢失原因存在一定的争议。作者以前研究以及其他诸多研究者均证实，凋亡是光化学损伤以及其他视网膜变性疾病光感受图3 牛磺酸降低光照诱导c-jun表达器细胞丢失的主要机制4,8。近年研究发现，转录因子AP-1亚单位c-fos/c-jun是参与光化学应激诱导感光细胞凋亡的重要调控因子。AP-1 通过调节靶基因转录参与机体内病生过程，脂多糖、氧化应激、紫外线等均能诱导其活性增加9。c-fos基因敲出大鼠（c-fos-/-）经光照后，视网膜光感受器细胞几乎未丢失，而野生型大鼠、小鼠和661W光感受器细胞在光照后其c-fos表达也呈现应急性增高，这些研究结果显示c-fos 在光诱导光感受器细胞凋亡中有促凋亡作用10。但AP-1的表达在牛磺酸防护视网膜光损伤中是否发生改变，尚未得到实验证实。本研究发现光照可引起视网膜c-fos/c-jun mRNA和蛋白的表达上调，膳食牛磺酸可在转录和翻译水平下调c-fos/c-jun表达（图2，图3）。基于上述结果，我们进一步推论出牛磺酸可减少AP-1复合物的形成，阻断了光照诱导的光感受细胞的凋亡信号途径，但其中涉及的分子机制仍需进一步阐明。【参考文献】 1Glickman RD.Phototoxicity to the Retina:Mechanisms of DamageJ.Int J Toxicol,2002,21(6):473-490.2Ranchon I,Gorrand JM,Cluzel J,et al.Functional Protection of Photoreceptors from Light-induced Damage by Dimethylthiourea and Ginkgo Biloba ExtractJ.Invest Ophthalmol Vis Sci,1999,40 (6):1 191-1 199.3Yu X,Chen K,Wei N,et al.Dietary Taurine Reduces Retinal Damage Produced by Photochemical Stress via Antioxidant and Anti-apoptotic Mechanisms in Sprague-Dawley RatsJ.Br J Nutr,2007,98(4):711-719.4陈卡，糜漫天，余小平.牛磺酸对大鼠视网膜光化学损伤的防护作用J.营养学报,2006,28(1):19-22.5Grimm C,Wenzel A,Behrens A,et al.AP-1 Mediated Retinal Photoreceptor Apoptosis Is Independent of N-te