甲状腺癌中端粒酶逆转录酶mRNA和Survivin的表达及意义.doc

甲状腺癌中端粒酶逆转录酶mRNA和Survivin的表达及意义 作者：钱婀娜，徐正顺，王仰坤 【摘要】 目的： 探讨甲状腺癌（TC）中端粒酶逆转录酶（TERT）mRNA和survivin蛋白的表达与细胞增殖和凋亡的关系. 方法：采用原位杂交法、末端脱氧核苷酸酶标记法及免疫组化技术检测46例TC中TERT mRNA、细胞凋亡、增殖细胞核抗原（PCNA）和survivin蛋白的表达，20例良性病变作为对照. 结果： TC的TERT mRNA和survivin的表达阳性率,增殖指数（PI）,凋亡指数（AI）均显著高于对照组；TC中TERT mRNA和survivin的表达均与临床分期有关，survivin还与淋巴结转移有关；二者的表达呈显著正相关；TERT mRNA和survivin阳性表达的TC组织AI明显低于阴性组，而PI均显著高于阴性组（P0.05）. 结论： TERT和survivin特异性的表达于TC组织中，可能通过促细胞增殖和抗凋亡途径，参与TC的发生发展. 【关键词】 甲状腺肿瘤 细胞凋亡 细胞增殖 端粒酶逆转录酶 存活素蛋白【Abstract】 AIM: To investigate the expressions of survivin protein and telomerase reverse transcriptase (TERT) mRNA and their relationships with cellular proliferation and apoptosis in thyroid carcinoma(TC). METHODS: The terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick end labeling technique was introduced to measure the apoptosis index(AI). Expressions of TERT mRNA and the protein of survivin,proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in 46 cases of thyroid carcinoma were respectively determined by in situ hybridization and immunohistochemical staining. Twenty cases of benign lesions were taken as control group. RESULTS：The positive staining rates of TERT mRNA,survivin and AI,proliferation index(PI) in TC were higher than those in control group (P0.05).The expressions of TERT mRNA and survivin in TC were related to clinic stage(P0.05). At the same time,the expression of survivin was related to lymph node metastasis. In TC group,the expression of TERT mRNA was positively correlated with the expression of survivin. In the TC group,PI in patients with positive survivin or TERT mRNA expression was higher than that in patients with negative survivin or TERT mRNA expression,however,the AI was lower than that in patients with negative survivin or TERT mRNA expression（P0.05）. CONCLUSION: Survivin and TERT are specifically expressed in TC and are probably involved in the pathogenesis of TC via inhibiting apoptosis and up-regulating cellular proliferation.【Keywords】 thyroid neoplasms；apoptosis； cell proliferation；telomerase reverse transcriptase； survivin protein0 引言甲状腺癌（thyroid carcinoma，TC）的发生是多因素共同作用的结果. 细胞增殖与凋亡平衡的紊乱与肿瘤的发生密切相关1；端粒酶使细胞获得无限增殖能力，端粒酶逆转录酶（TERT）是维持其活性最重要的成份；存活素（survivin）作用于多种凋亡通路末端效应分子，抑制细胞凋亡；细胞增殖核抗原（PCNA）可反映肿瘤细胞增殖活性. 本实验研究TC中TERT mRNA、survivin蛋白的表达及与细胞增殖和凋亡的关系，探讨TERT和survivin与甲状腺滤泡上皮癌变的关系及可能的机制，为TC的靶基因治疗、预后等基础和临床研究提供理论依据.1 材料和方法1.1 材料 收集解放军第150中心医院2001/2006手术切除的TC标本共46（男15，女31）例,中位年龄46.5（1872）岁. 乳头状癌（PTC）34例,滤泡状癌（FTC）12例；局部淋巴结转移18例，未转移28例；根据美国癌症联合委员会（AJCC）2002年分期标准2将TC分为期15例、期13例、期14例、期4例. 患者术前均未接受化疗、放疗或免疫治疗. 另取结节性甲状腺肿10例,甲状腺滤泡状腺瘤10例作为对照，标本均经40 g/L甲醛固定，石蜡包埋，3 m厚连续切片，HE染色观察细胞形态和组织学结构. TERT mRNA原位杂交试剂盒购自武汉博士德公司；兔抗人survivin多克隆抗体、鼠抗人PCNAmAb、SP免疫组化试剂盒、细胞凋亡原位检测试剂盒（德国Roche公司产品）,DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物有限公司.1.2 方法1.2.1 hTERT mRNA表达检测 所有器具预先均给予防RNA酶污染特殊处理，操作步骤严格按试剂盒说明书进行，新鲜DAB显色，苏木素复染，2SSC代替杂交液作为阴性对照,随试剂盒阳性片作阳性对照. TERT mRNA原位杂交阳性信号定位于细胞胞质，利用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统细胞测量程序对所有切片进行半定量检测，在400倍光镜下观察10个视野，计数1000个细胞,按阳性细胞数所占比例分为4个等级：细胞浆内不着色为阴性（-），阳性细胞数25 %为弱阳性(+)，阳性细胞数26%50%为阳性（），阳性细胞数50%为强阳性（）.1.2.2 survivin和PCNA表达检测 采用柠檬酸钠缓冲液高压修复，SP法，按试剂盒说明书进行，4过夜，新鲜DAB显色，苏木素复染，PBS代替一抗作为阴性对照，随试剂盒阳性片作阳性对照. survivin免疫组化阳性信号定位于细胞胞质，偶或胞核，有报道认为胞核的表达提示预后不佳3. survivin蛋白结果判定4： 无着色为0分，淡黄色记1分，棕黄色记2分，棕褐色记3分；阳性范围记分：每张切片在光镜下随机观察10个高倍视野，各计数100个细胞，计算出阳性细胞百分比，阳性细胞率5%记0分，5%-25%记1分，26%-50%记2分，51%-75%记3分，75%以上记4分. 上述2项结果相乘：0分为阴性（-），1-2分为弱阳性（+），3-6分为中等阳性（），6分为强阳性（）. 细胞核呈棕黄色者为PCNA阳性细胞，PCNA表达水平以PCNA标记的增殖指数（proliferation index，PI）表示. 在高倍镜（400）下随机选取10个视野，观察计数1000个细胞中的阳性细胞数，计算阳性细胞百分率，PI=阳性细胞数/观察细胞数100.1.2.3 原位细胞凋亡检测方法 滴加TUNEL反应混液置湿盒中，滴加转化剂POD，新鲜DAB显色，苏木素复染，PBS代替TUNEL反应液作为阴性对照，随试剂盒阳性片作阳性对照. 凋亡细胞阳性信号位于细胞核内，呈黄色或棕黄色，并且核染色质浓缩、边聚，附着于核膜内表面，形成新月体形或环状，核碎裂者为凋亡细胞. 细胞凋亡程度以凋亡指数（apoptosis index,AI）表示. 在高倍镜下任选10个视野，共计1000个细胞，计算凋亡细胞百分率. AI=阳性细胞数/观察细胞数100. 统计学处理：采用SPSS11.5统计软件进行t检验、2 检验，两指标间相关性采用Spearman等级相关分析. 进行双侧检验，当P0.05时为差异有统计学意义.2 结果2.1 TERT mRNA，survivin蛋白在不同甲状腺病变中的表达 TC中TERT mRNA阳性率为73.91%（34/46），高于对照组的5.00%（1/20,P0.01）；survivin蛋白阳性率为63.04%（26/42），高于对照组的5.00%（1/20,P0.01）. 对照组中的AI和PI分别为（1.781.02），（12.247.56）低于癌组的（5.092.38）和（35.4615.47）（t=7.93，t=8.18，P0.05）.2.2 TERT mRNA和Survivin的表达与甲状腺癌临床病理的关系 TC中，TERT mRNA和survivin的表达与临床分期有关（P0.05），同时TERT mRNA还与局部淋巴结转移有关，二者与性别、年龄、病理分型均无关（P0.05，表1）. 且二者的表达呈正相关（rs=0.34，P0.05，表2）.2.3 TERT mRNA和survivin蛋白的表达与细胞凋亡和增殖的关系 凋亡细胞散在或成簇分布，周围无炎性细胞浸润. PCNA免疫组化染色，癌细胞的胞核呈棕黄色者为阳性细胞. 在甲状腺癌中，TERT mRNA表达阳性组AI和PI分别为（4.652.28），（40.2913.88），在TERTmRNA表达阴性组中分别为（6.352.30），（21.7611.12），阳性组的AI低于阴性组（t=2.21，P0.05），而PI高于阴性组（t=4.17，P0.05）；survivin蛋白表达阳性组AI和PI分别为（3.971.82），（40.0215.28），阴性组AI和PI分别为（7.021.99），（27.6812.75），两组间的AI及PI均有统计学差异（t=5.31，t=2.80，P0.05）.3 讨论 本实验我们应用原位杂交的方法,检测TC中TERT mRNA的表达高于良性病变，且临床分期越高其表达越明显，国外学者Asaad等5也有相似的研究结论. 恶性程度较高者TERT mRNA阳性率较高，说明端粒酶活化在甲状腺癌的增殖、分化及发生、发展中起着重要的作用,TERT可成为甲状腺癌诊断的一种方法. 通过免疫组化SP法检测Survivin蛋白的表达，发现TC中survivin蛋白表达阳性率显著高于对照组，淋巴结转移的、分期越高、转移进展越快的TC，survivin蛋白表达就越明显，显示survivin在TC的发生、发展及转移过程中发挥重要的促进作用.表1 TERT mRNA和survivin蛋白的表达与42例甲状腺癌临床病理关系的比较（略）表2 甲状腺癌组TERTmRNA和survivin蛋白表达相关性（略）细胞增殖与凋亡失衡同肿瘤的发生发展密切相关. PCNA是真核细胞DNA合成所必需的一种36 kb核蛋白，被视为评估肿瘤细胞增殖活性的一个标记物. 本研究，在TC中，AI和PI均显著高于良性病变，可见高凋亡、高增殖现象存在于甲状腺癌，但癌组织中细胞凋亡的速度低于异常细胞增殖的速度，因此细胞累积率逐渐增高. 在TERT mRNA和survivin蛋白表达的阳性组中，PI均显著高于阴性组，提示端粒酶的激活过程伴随着甲状腺癌细胞增殖活性的增加，survivin促进细胞增殖的确切调控机制尚不清楚，可能survivin与CDK4直接作用，导致CDK2/Cyclin E激活与Rb磷酸化，导致细胞失控性生长6. 我们研究发现，TERT mRNA阳性表达组中的AI显著低于阴性表达组，端粒酶的激活及凋亡失控均与肿瘤发生有关，二者的相关性引起关注，Ramirez等7指出，在DNA损伤时发生凋亡的早期阶段细胞端粒序列快速而显著丢失. 同样，survivin阳性组的AI明显低于阴性组，survivin抗凋亡机制可能是在细胞周期G2/M期与有丝分裂纺锤体微管蛋白连接，使纺锤体微丝上的效应半胱氨酸天冬酶（caspase）处于抑制状态，抑制了异常突变的细胞的凋亡. 本实验中TERT mRNA和survivin表达呈正相关，均在甲状腺癌中高表达，且都与临床分期有关. TERT的调节作用主要出现在G1/S期，survivin在细胞周期的G2/M期高表达而逃逸凋亡关卡，二者在不同环节影响细胞周期进程，共同推动细胞增殖周期进程. Endoh等8将survivin基因转染至LS180人肿瘤细胞,发现TERT核心蛋白Sp1和C-Myc的磷酸化程度升高,因而促进肿瘤细胞TERT基因转录，因此survivin可能是使端粒酶活性增高的细胞因子，survivin作用于TERT的确切机制，还有待进一步研究和探讨，二者可能通过各自的信号途径在恶性肿瘤的发生和发展中起协同作用. survivin和TERT共同的生物学特点,使其成为肿瘤研究中的热点，将二者有关的基因或蛋白结合起来应用可提高对甲状腺肿瘤的早期诊断. 同时，以survivin或(和) TERT为靶点基因治疗甲状腺癌的研究正在积极进行中，Zeiqer等9以端粒酶为靶点，利用反义寡核苷酸技术、直接抑制TERT的免疫疗法和使用端粒酶启动子的细胞毒疗法来探寻治疗甲状腺癌的有效方法；Du等10研究表明,survivin反义寡核苷酸能够显著下调survivin mRNA及蛋白的表达，诱导甲状腺癌细胞凋亡，抑制细胞增殖. 随着TERT与survivin基因在肿瘤发生中作用的研究不断深入，也将为甲状腺肿瘤的诊断、基因治疗和肿瘤的耐药机制的研究不断开拓新的思路.【参考文献】 1 Bowen AR，Hanks AN，Murphy KJ，et al. Proliferation，apoptosis，and survivin expression in keratinocytie neoplasms and hyperplasiasJ. Am J Dematopathol,2004,26（3）: 177-181.2 万德森. 临床肿瘤学M. 2版. 北京：科学出版社，2005： 243-244.3 Shinohara ET,Gonzalez A,Massion PP,et al. Nuclear survivin predicts recurrence and poor survival in patients with resected nonsmall cell lung carcinomaJ. Cancer,2005,103(8):1685-1692.4 Lo Muzio LL,Farina A,Robini C,et al. Survivin as prognostic factor in squamous cell carcinoma of the oral cavityJ. Cancer Lett,2005,225(1):27-33.5 Asaad NY,Abd El-Wahed MM,Mohammed AG,et al. Human telomerase reverse transcrip-tase (hTERT) gene expression in thyroid carcinoma:Diagnostic and pPrognostic role J. Egypt Natl Cancer Inst,2006,18(1):8-16.6 Kuttler F,Valnet-Rabier MB,Angonin R,et al. Relationship between expression of genes involved in cell cycle control and apoptosis in diffuse large B cell lymphoma:a