糖尿病足不同辨证分型RAGE、IGF1R基因表达.doc

糖尿病足不同辨证分型RAGE、IGF-1R基因表达 作者：李晓军， 计小清， 张庚扬【摘要】 目的检测不同中医辨证分型糖尿病足患者截肢标本中RAGE、IGF-1R基因表达，以探讨其在糖尿病足发病中的作用，并分析其在不同证型间的关联性。方法选择糖尿病足患者最为常见的气阴两虚瘀阻、气血两虚瘀阻、脉络热毒三种证型，以截肢的肌肉组织为标本，并以正常截肢患者的标本为对照，制备RNA，并逆转录，实时荧光定量PCR技术分析RAGE、IGF-1R的含量。结果3种证型间RAGE、IGF-1R的含量无统计学意义，但与正常对照组相比均具有统计学意义。结论RAGE、IGF-1R基因表达量的改变与糖尿病足的发病有关，但在截肢阶段各证型间无显著关联性，不能作为中医辨证分型的微观依据。 【关键词】 糖尿病足; 糖基化终末产物受体; 胰岛素样生长因子-1受体; 实时荧光定量聚合酶链反应; 基因表达; 关联性糖尿病足是糖尿病患者的重要并发症,是糖尿病致残、致死的重要原因，严重者可因合并感染引起肢端坏疽,称为糖尿病坏疽，约有5%10%的患者需进行截肢手术。目前对糖尿病足病理机制还不完全清楚,但目前已认识到与体内的高糖环境、病理产物的蓄积，细胞因子的缺乏或功能低下等多方面因素有关，终末糖基化产物受体作为信号转导受体介导糖基化终产物(AGEs)和其配体在细胞表面结合,激活细胞内多种信号转导机制,在糖尿病慢性并发症发生中起重要作用。胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)与胰岛素样生长因子1(IGF-1)特异性结合后引起的信号通路不仅参与调控细胞增殖和分化，而且还能够抑制细胞趋向凋亡。本实验试从分子生物学的角度，探讨 (RAGE)及胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)的表达，并分析其与中医辨证分型间的关联性。1 材料与方法1.1 样本来源32例均为天津中医药大学第一附属医院2005-082006-07住院患者,其中男25例，女7例，年5187岁，平均66.7岁。糖尿病病程最长32年,最短7年,平均(192.7)年。1.2 诊断标准糖尿病足的诊断标准采用2000年中华医学会糖尿病学会第2届糖尿病足会议所制定的“糖尿病足(肢端坏疽)检查方法及诊断标准”。1.3 截肢标准参照国际糖尿病足工作组编写的糖尿病足国际共识1中关于“大截肢的定义、标准和指标”执行。具体标准是：进行性缺血性坏死中严重的静息痛，因某些原因无法通过血管重建、药物控制或小截肢来减轻的严重疾病状态，或虽然没有显著的动脉病变，但有严重的进行性糖尿病足感染，伴有或不伴有败血症，通过清创和最佳的保守治疗包括使用针对感染微生物的抗生素均不能控制病情;或严重的神经性骨关节病变性畸形。1.4 中医辨证分型标准参照中医外科学(第7版)及中药新药临床研究指导原则脱疽之中医辨证分型方案分为气阴两虚淤阻、气血两虚淤阻、脉络热毒型3种常见分型。1.5 标本取材坏疽截肢标本24例，其中按中医辨证分型分为气阴两虚瘀阻、气血两虚瘀阻、脉络热毒型各8例，另取正常创伤截肢标本8例，留取腓肠肌，于液氮中保存备用。1.6 设备与试剂Universal 16R 低温高速离心机(Beckman公司);ABI Prism7000 PCR仪(ABI公司,美国); RT-PCR二步法试剂盒(宝生物工程有限公司)TRIZOL Reagent(Invitrogen公司)Tris、DEPC(美国SIGMA公司)。1.7 引物的设计与合成引物序列检索自Primer Bank，使用计算机引物设计网站Primer 3和引物分析软件OLIGO设计。引物序列如下：GAPDHF: 5-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC，GAPDHR: 5-GAAGATGGTGATGGGATTTC，RAGEF: 5-GCTGGAATGGAAACTGAACACAGG，RAGER: 5-TTCCCAGGAATCTGGTAGACACG，IGF-1RF: 5-CGATGT GTGAGAAGACCACCA，IGF-1RR: 5-ACATTTTCTGGCAGCGGTTT，(由北京三博远志生物技术有限公司合成)。1.8 总RNA提取与cDNA的合成按照操作说明书进行样本组织总RNA提取和cDNA的合成。反转录反应配液为：5ExScriptTM Buffer 2 l，dNtp 0.5 l，olidt 0.5 l，ExScript TMR Tase 0.25 l，RNase inhibitor 0.25 l，Total RNA 0.4 g，RNase Free dH2O补到10l。42反应15 min，95加热2 min，-20保存备用。实时PCR反应的配液为：SYBR Premix Ex Taq 25l，PCR Forward primer 1l，PCR reverse Primer 1 l，Dye 1 l，模板(cDNA溶液) 2 l，d H2O 20 l。反应条件设置为:95，10 s,然后95，5 s，60，31 s进行40个循环。反应完成后，得到所的标本的记录点曲线。软件自动进行数据分析，计算出Ct(Threshold cycle)值。1.9 统计学处理应用SPSS13.0软件进行统计学分析，各组计量资料均以s表示。用One-way ANOVA(单因素方差分析)进行各组间的比较。2 结果RAGE值各证型组组间无统计学意义，但与正常组相比，均有统计学意义(P<0.05); IGF值各证型组组间无统计学意义，但与正常组相比，均有统计学意义(P<0.01)。结果见表1。表1 各糖尿病足证型组与正常对照组RAGE、IGF-1R的基因水平3 讨论糖尿病患者体内持续高糖条件下，蛋白质的氨基与糖的醛基在非酶催化的化学反应下生成糖基化终末产物(AGEs)，引起局部皮肤组织 AGEs 蓄积24。AGEs 通过直接作用和受体途径引起组织、细胞功能的紊乱57。AGEs 可导致其它蛋白质的糖基化;生长因子及其受体糖基化使具有功能活性的生长因子及其受体减少，或信号分表达和功能发生变化，进而影响修复细胞的增殖及迁移，从而影响创面修复。终末糖基化产物受体(RAGE)是一种膜蛋白，属于免疫球蛋白家族，由400多个氨基酸组成，分子量为35kD，分胞外段、跨膜段和胞内段，在单核巨噬细胞、血管内皮细胞、肾系膜细胞、神经细胞及平滑肌细胞等细胞中普遍表达。RAGE作为信号转导受体介导糖基化终产物(AGEs)和其配体在细胞表面结合,激活细胞内多种信号转导机制,在糖尿病慢性并发症发生中起重要作用。和其他受体不同，RAGE的作用并非清除体内的AGES，而是介导并放大了细胞对AGE的大部分应答反应8。AGES与RAGE结合可以引发多种效应，可以激活某些关键的细胞信号传导途径9，如NF-B途径、Janus激酶一信号传导和转录激活因子(JAK-STAT)途径等，激活一些细胞豁附分子的关键基因，从而诱导多种氧自由基以及细胞因子如促凝血因子、内皮素-1、血管细胞粘附分子-1 ( VCAM-1)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)，IL-6，TNF-, VEGF, TGF-, IGF-1等的产生，从而引起血管内皮损伤、血流动力学和血液流变学异常、细胞基质异常增生以及新生血管形成等一系列病理变化，持续性的慢性炎症反应阻碍了细胞外基质的沉积、塑型、及伤口愈合10。本实验中RAGE呈高水平表达，三个证型间表达无统计学意义，这有可能是糖尿病足难愈的因素之一。同时说明RAGE的表达水平在基因层面尚不能作为中医辨证分型的特异性指标。成熟的IGF-1R是由两个亚基和两个 亚基通过二硫键结合而形成的四聚体。IGF-1与亚基特异性结合，引起 亚基上酪氨酸残基自身磷酸化后，通过激活磷脂酰肌醇信号通路，促进细胞增殖，诱导细胞分化，加速伤口愈合11。IGF-1与其受体特异性结合后引起的信号通路不仅参与调控细胞增殖和分化，而且还能够抑制细胞趋向凋亡12。近期研究发现创面修复迟缓的根本原因在于细胞因子受体或其下游信号分子表达和功能发生了变化，影响细胞因子引起的信号传递和核内目的基因表达。以往的研究发现，在溃疡组织中，有研究显示在溃疡组织细胞因子蛋白表达减少的同时，导致 IGF-1R 低表达，引起其抗凋亡的活性减弱，使得处于低氧和缺乏营养环境中的组织修复细胞大量凋亡，最终导致肉芽组织生长缓慢，数量减少，伤口愈合延迟。因此溃疡组织内IGF-1R 蛋白低表达可能是创面修复细胞趋向凋亡，伤口愈合迟缓形成溃疡的原因之一13，本实验从分子层面部分解释了糖尿病足患者疮面难愈，最终导致截肢的部分病理机制，其它可能的机制仍需要进一步的探讨。两个指标在三种中医辨证分型中没有统计学差异，可以认为在截肢这一糖尿病并发症的严重阶段这两个指标与中医证型的关联性不强，尚不能作为中医辨证分型的微观依据。【参考文献】 1 陈宜张.分子神经生物学M.北京:人民军医出版社,1995:247.2 Nessar Ahmed. Advanced glycation endproducts-role in pathology of diabetic complicationsJ. Diabetes Research and Clinical Practice，2005，67:3.3 Stiss AW，Jenkins AJ，Cooper ME. Advanced glycation end products and diabetic complicationsJ. Expert Opin Investing Drugs，2002，11(9): 1205.4 Collison KS，Parhar RS， Saleh SS， et al. RAGE-mediated neutrophil dysfunction is evoked by advanced glycation end products(AGEs)J. J Leukoc Biol，2002， 71(3):433.5 Wolf G. New insights into the pathophysiology of diabetic nephropathy: from haemodynamics to molecular pathologyJ. Eur-J-Clin-Invest，2004，34(12): 785.6 Takeuchi M， Yamagishi S. Alternative routes for the formation of glyceraldehyde-derived AGEs (TAGE) in vivoJ. Med-Hypotheses，2004，63(3): 453.7 Jakus V，Rietbrock N. Advanced glycation end-products and the progress of diabetic vascular complicationsJ. Physiol-Res，2004， 53(2): 131.8 Wendt T, Tanjl N, Guo J, et al. Glucose, glycation, and RAGE; implications for amplifyication of cellular dysfunction in diabetic nephropathy. J Am Soc NephrolJ. 1 Am Soc Nephrol, 2003. 14(5).1383.9 Tanaka N, Yonekura H, Yamagishi S. et al. The receptor for advanced glycation end products is induced by the glycation products themselves and TNF-a through NF-B, and by 17 estradiol through sp-1 in human vascular endothelial cellsJ. J Biol Chem, 2000, 275:25781.10 Marilena Chinali Komesu，Marcelo Benetti Tange， Kemli Raquel Buttons， et al. Effects of acute diabetes on rat cutaneous wound healingJ. Pathophysiology. 2004，11:63.11 GHAHABY A, SHEN YJ, WANG R, et al. Expression and localization of insulin-like growth factor-1 in normaland post-burn hypertrophic Sral tissue in human J .Mol c