肠球菌溶血素的表型及基因型检测.doc

肠球菌溶血素的表型及基因型检测【摘要】 目的观察大鼠全脑照射后海马区肿瘤坏死因子（TNF）的动态表达，探讨其在放射性脑损伤急性期的反应发病机理中可能的作用。方法制备大鼠的脑放射诱导损伤模型。利用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）技术半定量分析大鼠脑放射诱导损伤后海马区在不同时间、不同剂量水平TNF基因转录的动态表达。结果正常组海马区TNF mRNA低水平表达；全脑照射组表达上调并在1 h达峰值，是正常组的411倍（P<0.001）；放射诱导呈剂量依赖性（P<0.01），30 Gy组较2 Gy组增高近2倍（P<0.001），较15 Gy组增高近1倍（P<0.01），15 Gy组也高于2 Gy组；各照射组在12 h后恢复到基础水平。结论大鼠全脑照射后海马区TNF基因表达上调，放射诱导呈剂量依赖性，提示参与了脑放射诱导损伤急性期的细胞反应。 【关键词】 肿瘤坏死因子 脑损伤 海马 疾病模型 动物 放射性脑损伤是头颈部肿瘤提高放射治疗疗效的重要障碍之一，一些亚急性期和晚期并发症的影像学和组织学变化已比较明确，但急性期的细胞和分子反应以及如何进展为晚期损伤的机理目前尚不清楚。已有实验证实诱发脑损伤的一个重要因素是细胞因子的过度表达，损伤特征性变化如脑水肿、神经胶质增生及脱髓鞘都与前炎性细胞因子的产生密切相关1。肿瘤坏死因子（TNF）是一种典型的细胞因子，在各种损伤反应的分子网络中都有重要作用，如在脑放射诱导损伤各反应期都可观察到与其它细胞因子不同的变化2。笔者观察大鼠脑放射诱导损伤后海马区TNF mRNA的动态表达，探讨其在放射性脑损伤早期的反应机制中可能的作用。 1材料与方法 1.1动物 1.1.1模型制作68周龄SD雌性大鼠100只由厦门大学动物中心提供动物合格证号为SCXK（沪）20040005，体质量(20020)g。脑放射诱导损伤模型参照文献3制作。3.6%水合氯醛按1 mL/100 g麻醉，予直线加速器4 MeV电子线全脑照射，照射范围包括双眼至耳根区域。 1.1.2分组按不同单次照射剂量2，15，30 Gy和照射后不同观察时间1，6，12，24，48 h和7 d分为18组，另设假照射组（麻醉后不进行照射）和正常组（不麻醉不照射）为对照，共计20组，每组5只。断头处死后随机取一侧海马，立即置于无RNA酶的Ep管中，-196 液氮保存。 1.2方法 1.2.1总RNA的提取按说明书用Trizol试剂(上海生物工程公司)提取总RNA。经紫外分光光度计测定D（260 nm）/D（280 nm）在1.72.0，计算总RNA含量，电泳证实18 S和28 S条带清晰。 1.2.2逆转录合成cDNARNA 2 g以Oligo(dT)18为引物，20 L反应体系在70 预变性5 min；再加入5RT buffer、dNTP、RNasin和MMLV共40 L，体系在37 反应45 min。 1.2.3PCR扩增取cDNA 5 L用于扩增。50 L反应体系中加入10buffer、MgCl2、dNTP、TaqDNA聚合酶、正义和反义引物。PCR的反应条件为94 30 s60 30 s72 60 s，共33个循环。以actin为内参照，扩增产物7.5 L和actin 5 L混合在1.5%琼脂糖凝胶电泳。结果采用计算机数字扫描密度影像分析仪进行半定量分析。PCR所采用的引物根据Genebank及软件设计,由上海生物工程公司合成。序列如下： TNF（438 bp）： F：5GGT GAT CGG TCC CAA CAA GG3 R：5CCT CCC AGG TAC ATG GGC TC3 actin （332 bp）： F：5CTG GAG AAG AGC TAT GAG C3 R：5AGG ATA GAG CCA CCA ATC C3 1.3统计学处理以内参照actin光密度值标化TNF光密度值，得到TNF的相对含量，结果用xs表示。应用SPSS 11.0软件进行统计分析。对时间和照射剂量作双因素F检验，对有显著差异组样本均数作t检验。 2结果 全脑照射前海马区TNF mRNA表达维持在低水平，照射后基因表达上调（P<0.001），随照射剂量的增加而增高（P<0.001），在1 h达高峰，是正常组的411倍，6 h仍显著高于正常，12 h后表达均恢复到基础水平，在7 d内未见再次上升；在6 h时间点15 Gy组数值较2 Gy和30 Gy组低，差别有统计学意义。照射组与正常组、假照射组比较，结果相同，提示麻醉不影响实验结果（图1，表1）。 表1大鼠全脑照射后海马区TNF表达 3讨论 大脑肿瘤的放射治疗可能会伴随发生亚急性和晚期并发症的危险，其病理特征是脱髓鞘、神经元缺失、脉管系统损害和神经胶质增生。并发症的程度因照射剂量、靶体积、人种和其他因素的不同而不同。尽管这些并发症在照射后需要一定的时间才有表现，但在无症状期观察到的细胞反应可能对决定这种最终结果发挥重要作用2,4。动物模型显示放射可以诱发脑内周期性的细胞级联变化，包括持续数天至数月的神经胶质增生、导致脱髓鞘变化的少突胶质细胞缺失及血脑屏障损害,这些变化都与前炎性细胞因子的产生密切相关1。TNF作为一种重要的前炎性细胞因子在上述条件下均可观察到明显的变化，故目前一致认为它参与了损伤与修复过程5。 已有的文献资料认为，鼠脑放射的平均致死剂量（LD50）为32.4 Gy1，而在脑肿瘤立体定向放射治疗中也经常应用此范围的单次剂量。本实验选择2，15，30 Gy 3个不同的剂量点也是基于此考虑。结果显示，照射前海马区TNF基因表达维持在低水平，照射后表达上调，峰值在照射后1 h，是正常组的411倍，6 h表达仍显著高于正常，12 h后恢复到基础水平；水合氯醛麻醉处理并不增加TNF的表达。尽管在6 h时间点15 Gy组数值较2 Gy和30 Gy组低，差别有统计学意义，提示仍有剂量依赖性，可能为实验误差。文献报道脑放射诱导损伤后细胞因子上升峰值时间在28 h，24 h后恢复正常46。而本实验的峰值时间和恢复时间都较之提前，可能与脑照射体积扩大、损伤加重和修复加快有关。Chiang等的结果显示，即使低剂量辐射条件下也可观察到TNF、IL1基因表达上调及蛋白含量升高6。Hong等报道脑放射诱导损伤后急性期前炎性细胞因子基因表达增高，峰值在4，24 h后恢复，这种变化可被皮质激素抑制4。 很多假说认为，大脑在受到电离辐射后过度表达的细胞因子和免疫调节分子可能参与了血管通透性增高、细胞毒性、星形细胞增生和神经胶质增殖的变化45。TNF作为一种典型的前炎性细胞因子，由单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和巨细胞刺激后产生，但近来发现星形细胞、小胶质细胞和神经元也是来源之一3，6。TNF在低水平表达时作为免疫系统的中间介质保护宿主免于各种感染和癌细胞的攻击，通过凋亡机制诱导癌细胞发生程序化死亡7，保护神经元免于兴奋性氨基酸的毒性8。而在表达增高时TNF则表现出明显的致病效应，在各种损伤刺激的分子网络中TNF均是一个重要的细胞因子，其表达水平的上调将诱发更广泛的分子级联反应，如诱导IL1、IL6和ICAM1的表达，最终引起临床症状910。笔者实验中讨论的是单次剂量照射条件下的分子变化，至于分次照射的反应，已有学者报道首次照射将诱发脑细胞发生脱敏效应，不应期的存在使得间隔24 h后的放射诱导损伤较前一次明显减轻11。 全脑照射后海马区TNF的表达明显增加并很快达峰值，随剂量增加而增高，24 h内恢复正常。笔者认为TNF参与了放射性脑损伤的进程，如果能了解损伤急性期的分子机制并加以干预，无论是对减轻治疗反应还是预防晚期并发症都是有益的。【参考文献】 1Chiang C S,McBride W H,Withers H R, et al. Radiationinduced astrocytic and microglial responses in mouse brainJ. Radiother Oncol, 1993,29:6068.2Chiang C S,Hong J H,Stalder A, et al. Delayed molecular responses to brain irradiationJ. J Radiat Biol, 1997,72:4553.3田野,包仕尧,殷蔚伯. 大鼠半脑照射后早期脑内血流量和含水量变化的研究J. 中华放射肿瘤学杂志, 1999,8:4346.4Hong J H,Chiang C S,Campbell I L, et al. Induction of acute phase gene expression by brain irradiationJ. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 1995,33(3):619626.5Kureshi S A,Hofman F M,Schneider J H, et al. Cytokine expression in radiationinduced delayed cerebral injuryJ. Neurosurgery, 1994,35:822830.6Chiang C S,McBride W H. Radiation enhances tumor necrosis factor alpha production by murine brain cellsJ. Brain Res, 1991,566:265269.7Wang C Y,Mayo M W,Baldwin A S, et al. TNF and cancer therapy induced apoptosis: Potentiation by inhibition of NFBJ. Science, 1996,274:784787.8Cheng B,Christakos S,Mattson M P, et al. Tumor necrosis factors protect neurons against metabolicexcitotoxic insults and promote maintenance of calcium homeostasisJ. Neuron, 1994,12:139153.9Chen T C,Hinton D R,Apuzzo M L, et al. Differential effects of tumor necrosis factor alpha on proliferation, cell surface antigen expression, and cytokine interactions in malignant gliomasJ. Neurosurgery, 1993,32:8594.10Kyrhanides S,Olschowka J A,Williams J P, et al. TNF and IL1 mediate intercellular adhesion molecule1 induction via microgliaastrocyte interac