表皮生长因子对体外长期孵育保存的人胎胰岛的支持作用.doc

表皮生长因子对体外长期孵育保存的人胎胰岛的支持作用 【关键词】 尿抑胃素 【Abstract】 AIM: To investigate the effects of epidermal growth factor (EGF) on the proliferation and secretion of human embryonic pancreatic islets in vitro. METHODS: Islets were isolated from pancreases of twelve human embryos and cultured in RPMI 1640 medium containing EGF (study group) or without EGF (control group). The percentage of islet beta cells was detected. The insulin content in the media, islet cells and islet beta cells insulin release were measured. RESULTS: By the end of culture, the percentage of islet beta cells was significantly higher in study group compared with that in control group. The insulin content of media and islet cells release was significantly higher in study group compared with that in control group. CONCLUSION: Results indicated that the addition of EGF to the media prolongs the survival time of islet cells and promote the proliferation and secretion of islet cells. 【Keywords】 islets of langerhans;preservation, biological;epidermal growth factorurogastrone 【摘 要】 目的： 研究表皮生长因子（EGF）对促进人胎胰岛增殖与分泌功能.方法: 12个人胎胰岛分别在含有EGF（实验组）和不含有EGF（对照组）的培养基中孵育，观察胰岛B细胞的分布，测定培养基中和细胞内胰岛素浓度和胰岛素释放量.结果: 培养结束后实验组胰岛B细胞明显高于对照组；培养基和胰岛B细胞中胰岛素释放量实验组高于对照组.结论: 培养液中加入EGF能延长胰岛细胞存活期、促进胰岛细胞增殖和分泌功能. 【关键词】胰岛；保存，生物学；表皮生长因子尿抑胃素 0 引言 为了有足够数量的健康胰岛供给临床移植使用，国内外都在积极研究长期保存胰岛的方法1,2.经典的深低温保存方法，需要较贵重的设备，操作繁杂，复苏后胰岛的失活率30%；孵育保存的方法胰岛难以长期存活，但只能维持1 mo，最多达5 mo3，胰岛细胞的调亡在所难免.我们研究了表皮生长因子（epidermal growth factor）具有促进人胎胰岛的增殖分泌作用.通过观察胰岛细胞的形态，测定细胞内胰岛素和胰岛释放量，以及胰岛组织的存活期，探讨更有意义的保存胰岛的方法. 1 材料和方法 1.1 材料 EGF购自美国Sigma公司，RPMI1640培养液、人血清购自北京帮定医药公司.百级净化实验室内，所有操作在洁净工作台进行. 1.2 方法 1.2.1 人胎胰岛的获取 平均胎龄21周的人胎胰12例.经4无菌Hanks液漂洗，去除胰腺包膜、血管、胰管，剪为1 mm大小的碎块，再次漂洗后置于培养瓶内. 1.2.2 孵育条件 RPMI1640培养液中加入80 mL・L-1同型人血清、丁胺卡那霉素100 u・mL-1；培养箱中37, 50 mL・L-1 CO2培养；隔日更换1/3培养液，共孵育14 d. 1.2.3 分组 12个人胎胰岛随机分为实验组和对照组.实验组：表皮生长因子（EGF），100 ng・mL-1约1 mL加入上述孵育胰岛14 d的培养瓶内，共6瓶.每次更换培养液时均按此浓度加入EGF.对照组:未加EGF培养瓶做为对照组,共6瓶.更换培养液时也不加EGF. 1.2.4 观察指标 免疫组织化学的病理学观察：不同孵育时限分别收集胰岛细胞，100 mL・L-1甲醛固定，石醋切片，HE染色及胰岛素和高糖素抗体酶标染色，观察细胞有丝分裂相及胰岛B细胞分布情况. 不同孵育时限时胰岛功能指标的观察：培养液中胰岛素分泌量；胰岛素释放试验（低糖和高糖加茶碱刺激）. 统计学处理：实验数据用xs表示，采用方差分析进行组间均数比较. 2 结果 2.1 酶标组织化学染色的组织学结果 光学显微镜下随机计数100个胰岛的观察均值,每个胰岛中随机计数10个胰岛细胞中的组织学改变:有丝分裂细胞的比率、胰岛素和胰高血糖素分泌颗粒的数目等.孵育30 d以内，组间未观察到明显差异（P005）；3 mo时，对照组胰岛细胞内已无胰岛素和胰高血糖素的分泌颗粒，细胞核固缩或崩解；而ECF组的分泌颗粒至6 mo时仍不减少，9 mo时减少13.6%，细胞形态观察无明显变化.不同孵育时限的胰岛中有丝分裂细胞情况见Tab 1. 表1 不同孵育时限对胰岛中有丝分裂细胞比率的影响（略） Tab 1 Effect of islets beta cells rate in different cultured time (略) 2.2 不同孵育时限的胰岛功能指标观察结果 见Tab 2.胰岛素释放试验（低糖和高糖加茶碱刺激），与培养液中胰岛素分泌量的变化同步，对照组3mo以后对释放试验无反应,而ECF组反应敏感，并保持到9 mo以后. 表2 不同孵育时限时培养液中胰岛素分泌量的改变（略） Tab 2 Change of serection in insulin culture media in different culture time （略） 3 讨论 近年来，胰岛移植的研究集中在移植部位、移植途径、抗排异反应、和胰岛的保存等方面4,5.胰岛移植的临床应用中每一受体均需要足够量的成熟健康的胰岛6-8，而一般胰岛孵育保存的最佳时期在1 mo3.在此期间内，培养液中胰腺小块组织的外分泌组织和结缔组织细胞逐步退化减少，而胰岛组织能增殖和成熟1，9.但孵育1 mo后胰岛细胞开始凋亡，其分泌功能下降.1 mo的短时期内常不能积攒足够的胰岛，所以心须设法延长胰岛的孵育保存时间. 表皮样生长因子（EGF）的Mr为6000左右，热稳定，是含有5个氨基酸残基的多肽，存在于人和动物的尿液、乳汁和血浆中，对多种细胞是很强的促细胞分裂因子，能促进上皮细胞增殖、成熟、并保持活力10-12.但尚无EGF作用于胰岛保存的报道.在本实验中，胰岛形态学检查提示，含EGF培养液的孵育能刺激长期保存的胰岛正常分泌胰岛素和胰高血糖素；胰岛细胞中有丝分裂相的变化提示ECF对长期保存的胰岛细胞的增殖有显著的促进作用.培养液中胰岛素含量检测和胰岛素释放试验结果同样提示了上述结论. 在EGF作用下，孵育9 mo的胰岛仍保持较好对高糖、茶碱刺激的敏锐反应性.在胰岛细胞培养液中加入,可延长胰岛细胞存活期至10 mo以上，并促进细胞增殖，使胰岛细胞分泌旺盛.本研究为临床移植提供足量的健康胰岛奠定可靠基础. 【参考文献】 1 Schmied BM, Ulrich A, Matsuzaki H, Ding X, Ricordi C, Weide L, Moyer MP, Batra SK, Adrian TE, Pour PM. 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