枸杞多糖的提取与含量测定.ppt

,枸杞多糖的提取与含量测定,实验目的,1、掌握提取多糖的原理和方法； 2、掌握多糖的纯化原理及方法； 3、掌握多糖含量测定的原理及方法。,实验原理,多糖的提取方法 生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、动物多糖等等3大类。多糖的提取首先要根据多糖的存在形式及提取部位，决定在提取之前是否要做预处理。动物多糖和微生物多糖多有脂质包围，一般提取时需要加入丙酮、乙醚、乙醇或是乙酸乙酯的混合液进行回流脱脂，释放多糖。植物多糖提取时应该注意一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类，在提取前应先用低极性的有机溶剂对原料进行脱脂预处理，目前多糖的提取方法主要有溶剂提取法、生物提取法、强化提取法等等。,实验原理,易溶于水的多糖的提取 水提取多糖中的多糖大多是中性多糖。用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提。 结合多糖的提取 结合多糖主要指黏多糖。以新鲜组织或丙酮脱水的组织为原料，可用水或盐溶液提取部分多糖。但是，以为大多数的黏多糖是与蛋白质结合的，需要用酶降解蛋白质部分或用碱使多糖和蛋白质之间的糖肽键断裂，以促进黏多糖在提取时的溶解。在碱性提取的同时用蛋白酶处理组织，可将提取过程简化。提取液中存在的蛋白质可用普通蛋白质沉淀剂沉淀，也可用其他方法进行多糖的提纯。,实验原理,多糖的提取液一般浓度较低，需在提取后对提取液进行浓缩。浓缩的方法可根据性质确定，如对热比较稳定的多糖，可用加热蒸发或减压蒸出水分法；对于相对分子质量大的多糖可用超滤法。向多糖溶液中加入一定量的与水混溶的有机溶剂（如乙醇）可得到粗多糖的沉淀物。 Sevag法 Sevag法是自多糖中去除蛋白质的最缓和的方法，原理是利用蛋白质变性沉淀而多糖不沉淀出去蛋白质。将样品提取液与Sevag试剂按照5:1的比例混合，剧烈震荡后离心除去变性的蛋白质，反复多次至蛋白质除尽为止。该方法较为温和，配合蛋白质水解酶消化法使用效果更佳。,实验原理,蒽酮-硫酸比色法进行多糖的含量测定 糖类在较高温度下可被硫酸作用而脱水生成糠醛或羟甲基糠醛后，与蒽酮（C14H100）脱水缩合，形成糠醛的衍生物，成蓝绿色。该物质在620nm处有最大吸收，在150ug/ml范围内，其颜色深浅可与可溶性糖含量成正比。这一方法有很高的灵敏度，糖含量30ug左右就可进行测定，所以可作为微量测糖含量只用。一般样品少的情况下，采用这一方法比较合适。,实验试剂仪器,实验试剂 干燥枸杞子、葡萄糖标准溶液、蒽酮、浓硫酸、95%乙醇、无水乙醇、三氯甲烷正丁醇（4:1）。 实验仪器 分析天平、托盘天平、离心机（大）、离心机（小）、水浴锅、电炉、漩涡震荡仪、真空烘箱、分光光度计、800ml烧杯、100ml烧杯、离心管、分液漏斗、50ml容量瓶、玻璃棒、量筒、加盖试管若干。,实验内容,提取 粗略称取20g 枸杞于，粉碎后放入800ml 烧杯中，加500ml 蒸馏水，热水提取2h。过滤，加入1/4 体积的三氯甲烷正丁醇（4:1），剧烈振摇15min，3000rpm 离心25min，弃去中间变性蛋白和氯仿层，留用上清液。上清液于80水浴搅拌浓缩至50ml。在搅拌状态，将浓缩液加入3 倍体积95%乙醇中，室温静置1h 左右，3000rpm 离心10min，固形物用95% 乙醇洗涤，3000rpm离心10min,然后用无水乙醇洗涤，3000rpm离心10min, 真空干燥, 得LBP 粗品。,实验内容,标准曲线的绘制 取干燥试管6 支，按下表数据配置一系列不同浓度的葡萄糖溶液。,在620nm波长下以第一管为空白试验，迅速测量吸光值，以葡 萄糖含量（mg）为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘出标准曲线。,实验内容,枸杞多糖的含量测定 精密称定20mg 多糖粗品，溶于50ml 蒸馏水中，制成样品液。 分别吸取0.5ml，1ml 多糖溶液至试管中，加蒸馏水至总体积为1ml。冰浴中冷却，再加入4ml 蒽酮试剂，沸水浴中煮沸10min，取出后自来水冷却，620nm 比色，其他条件与作标准曲线同。测得吸光度值由标准曲线查出样品液的糖含量。,实验数据记录与处理,标准曲线的绘制 以下表格是不同浓度的标准葡萄糖溶液吸光度的实验数据。,即可得到如下标准曲线。,实验数据记录与处理,实验数据记录与处理,枸杞多糖的含量测定 根据标准曲线可以查得枸杞多糖样液吸光度的数值。,样液1含0.02367mg枸杞多糖， 样液2含0.04735mg枸杞多糖。,实验数据记录与处理,枸杞多糖的含量计算 根据已经查得的数值，可以进行一下计算 c（样品1）= （0.02367 mg / 0.5 ml）* 50 ml / 21.4 mg * 100% = 11.06% c（样品2）= （0.04735 mg / 1.0 ml）* 50 ml / 21.4 mg * 100% = 11.06%,注意事项,蒽酮-浓硫酸比色法的注意事项：该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，所以蒽酮法测出的碳水化合物的含量，实际上是溶液中可溶性碳水化合物的总量。不同的糖类和蒽酮试剂显色的深度不同，果糖最深，葡萄糖、半乳糖、甘露糖和五碳糖依次降低，因此测定糖的混合物的时候，常常因不同糖类的比例不同造成误差，但是测定单一糖类则可以避免此类误差。 在进行枸杞多糖的提取提纯的时候，一定要注意沉淀枸杞多糖所需乙醇的浓度，切不可加入无水乙醇而没有意识到乙醇浓度的降低，引起提取枸杞多糖的量的降低。,注意事项, 在Sevag法中，可以通过配合蛋白质酶消化法达到更好的提纯效果。 在进行枸杞多糖的定量测量的时候，一定要注意葡萄糖标准溶液以及样品的用量，否则会造成较大误差，标准曲线的绘制中要用线性回归进行拟合。 在进行620nm波长的吸