《核酸的提取分离》PPT课件.ppt

生化工艺学课件 第五章 核酸的提取分离,第五章 核酸的提取分离,5.1 概述 5.2 核酸的理化性质 5.3 核酸的作用与用途 5.4 动物脏器核酸的提取分离方法 5.5 转移因子的制备 5.6 辅酶A的提取 5.7 复合辅酶的提取 5.8 从啤酒酵母中提取RNA,5.1 概述,组成核苷酸的碱基,Fig. 2-4 The primary structure of DNA.,脱氧核糖核酸（DNA）主要存在于细胞核的染色体中，核糖核酸（RNA）主要存在于细胞的微粒体中，各种生物体含有核酸的多少不同 应用于临床的核酸及其衍生物类生化产品越来越多 我国人工合成丙氨酸转移核糖核酸，76个核苷酸，与天然酵母丙氨酸核糖核酸具有相同的化学结构，有接受丙氨酸、将携带的丙氨酸掺入到蛋白质中的生物活力,呈味核苷酸是目前国际上流行的新型鲜味剂，其学名为5IMP（肌苷酸钠）、5GMP（鸟苷酸钠）、IG（50IMP50GMP）， 我国第三代鲜味剂鸡精的特点为：由鸡肉、鸡蛋、呈味核苷酸、水解蛋白粉、味精及多种调味料复合而成。 核酸类的药物主要是核苷酸、嘌呤及嘧啶类相关的衍生物 保健品：某核酸公司宣称其产品具有增强基因自主修复能力，还能改善微循环、改善脑机能；促进新陈代谢、抗疲劳；提高免疫力；活化皮肤细胞、润肤美容。,核酸在食品和药品领域中的应用 ？,核酸工业的市场分析,核酸药物产品的开发已有近70年历史。目前，日本是核酸产品的最大生产国，其年产量约7500吨，约占世界产量的90%；西方国家中，意大利也有核酸产品，但产量不是很大。近年来，韩国核酸产业兴起，主要为调味品。 我国核酸产品的研究开发起步较早，并取得了令人瞩目的成就。然而目前我国核酸药物产品主要依靠进口，仅ATP一项每年就从日本进口金额达八千万美元,5.2 核酸的理化性质,5.2.1 核酸的一般性质 1、DNA分子与蛋白质分子、RNA相对分子质量？ 2、DNA白色纤维状固体，RNA白色粉末，均微溶于水，稀碱溶液中成盐后易溶于水，不溶于有机溶剂，但可溶于乙醇的水溶液，乙醇50（w/w）时，DNA析出，当75时，RNA也沉淀出来 溶解度差别分离,盐溶液中溶解度差异,提取RNA时NaCl盐溶液浓度仅为0.14mol/L即可 而提取DNA时，需先用0.14mol/L NaCl将RNA除掉，再继续增加NaCl浓度至1mol/L时才能够将DNA提取出来,5.2.1 核酸的一般性质,3、DNA极稀的溶液黏度极大，变性时黏度降低，pH超出5.6-10.9时，相对黏度突然降低 4、可被酸、碱或酶水解成各种组分，用层析、电泳等方法分离，主要利用： RNA的磷酸酯键对碱敏感：室温，0.31mol/L KOH，24h，可将RNA完全水解，得到2-或3-核苷酸的混合物。 DNA抗碱水解 生理意义：,DNA更稳定 ，遗传信息。 RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。,5.2.2 核酸的紫外吸收性质,嘌呤、嘧啶环共轭双键紫外吸收，核酸max 260nm附近，而min 230nm 1、鉴定纯度 纯DNA的A260/A2801.8； 纯RNA的A260/A280 2.0 若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280 2、 含量计算，吸光值为1.00时，相当于： 50ug/mL双螺旋DNA 或：40ug/mL单链DNA（或RNA） 或：20ug/mL寡核苷酸,DNA和RNA均在紫外光下有最高吸收峰，可采用OD260nm测定其浓度 另一方面DNA和RNA含磷含糖，所以可通过糖含量及磷含量的测定方法间接表征核酸的含量 RNA所含糖为核糖苔黑酚法测定； DNA所含糖为脱氧核糖二苯胺法测定。 含磷量测定时均需先经过消化将有机磷转变为无机磷才能测定，纯RNA含磷量为9，而纯DNA含磷量为9.2%。,5.2.3 核酸的变性和复性,高温（热变性）、酸碱（pH小于4或大于11）及某些变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）能破坏核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。,变性后的理化性质,DNA的变性是爆发式的，变性 作用发生在一个很窄的温度范围内。 粘度降低，浮力密度升高。 二级结构改变，部分失活。 260nm吸收值升高。 增色效应与减色效应 增色效应：在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大 减色效应：在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小。,熔解温度（Tm）：,DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度。 浓度50ug/mL时，双链DNA A260=1.00； 完全变性（单链）A260= 1.37 当A260增加到最大增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。 DNA的Tm一般在8295之间,影响DNA的Tm值的因素,1、DNA均一性 ：均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析DNA的均一性 。 2、G-C含量与Tm值成正比（why？）：测定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）2.44 3、介质中离子强度：离子强度高，Tm高，范围变宽。,G-C对中含有3个氢键，较A-T对中仅有2个氢键更为稳定,5.2.4 核酸的测定,1、紫外分光光度法 2、定糖法： DNA、RNA经酸水解后，嘌呤易脱下形成无嘌呤的醛基化合物，或水解得到核糖和脱氧核糖能与某些酚类、苯胺类化合物结合成有色物质（简便，定性or颜色深浅定量） RNA浓盐酸苔黑酚（3，5-二羟甲苯）共热绿色 DNA浓醋酸少量浓硫酸二苯胺共热蓝色 3、定磷法：DNA含磷量9.2%，RNA含磷量9 1g磷相当于11g核酸，消化后用钼酸胺定磷试剂,仅测得与嘌呤连接的糖,4、核酸分析时样品的预处理,用定磷、定糖或紫外吸收的方法测定某一生物材料中核酸或其水解物含量时，需先经预处理去掉杂质，避免干扰 1）将生物组织细胞在低温下磨碎成匀浆稀三氯乙酸or1高氯酸低温抽提几次，得到沉淀为蛋白质、核酸、脂类、多糖等 2）用有机溶剂抽提去除脂溶性磷脂等物质不溶于酸的非脂化合物如DNA、RNA、蛋白质、磷蛋白和少量磷化合物 再采用酸（5三氯乙酸或6高氯酸，90oC，15min，再定糖法测定）或碱处理法（37oC，0.3-1mol/L NaOH，18h，DNA，RNA能够分开）,5.3 核酸的作用与用途,核酸作用：与生物的生长、发育、繁殖、遗传和变异有密切关系，又是蛋白质合成不可缺少的物质诸多恶性肿瘤、遗传性疾病及放射病均与核酸改变有关 1、嘌呤和嘧啶类生化产品：核酸组成中的碱基嘌呤化合物和嘧啶化合物都有良好的抗肿瘤作用，阻断蛋白质、核酸的生物合成，抑制癌细胞的增殖，如：5-氟尿嘧啶 2、核苷类生化产品：如辅酶A 3、核苷酸类生化产品：如免疫核糖核酸iRNA、转移因子,5.4动物脏器核酸的提取分离方法,核酸及其衍生物类药物，属天然大分子，结构复杂采用生物材料为原料的提取法制造 核苷酸类及其衍生物，小分子，结构简单化学合成法 一、RNA的提取分离 动物组织捣碎匀浆0.14mol/L NaCl 溶液提取调pH至4.5，RNA.蛋白，RNA与蛋白质分开的方法： 1）乙醇沉淀法 2）盐酸胍和去污剂分离法 3）酚法,二、DNA的提取分离,利用核糖核蛋白在0.14mol/L NaCl可溶，而DNA核蛋白则可溶于水或高浓度的盐溶液（ 1mol/L NaCl ） 组织捣碎 0.14mol/L NaCl反复洗涤以去除RNA（或0.1mol/L NaCl 0.05mol/L NaCl 枸橼酸钠）去污剂SDS使蛋白质变性沉淀用1mol/L NaCl溶解乙醇沉淀去污剂精制，反复多次 常用去蛋白方法：含有新醇或异戊醇的氯仿沉淀核蛋白离心；SDS；苯酚处理，离心分层 提取核酸时要注意保持其完整性（防过酸、碱、低温）,5.5 转移因子的制备,Transfer factor （TF）一种多核苷酸和多肽小分子物质，为细胞免疫促进剂。可将供体的细胞免疫性转移给受体正常的淋巴细胞，并能促进释放干扰素。 临床用于免疫缺陷的病人，如感染、疱疹、乙肝、麻疹等。对恶性肿瘤可作为辅助治疗剂；作用无种属特异性 。 制备TF的原料除特异性供体白细胞外，一般采用正常人血液、脾和扁桃体等原料 提取工艺中主要采用透析、柱层析、超滤及加絮凝剂和助滤剂再过滤等,5.6 辅酶A的提取,辅酶A（Coenzyme A，CoA），是由等分子的泛酸、腺嘌呤、核糖、氨基乙硫醇和三分子磷酸构成，ADP的衍生物或类似物，相对分子量为767.54 主要起传递酰基的作用，来回接受和放出酰基，携带酰基的部位在SH上以HSCoA表示 对糖、脂类和蛋白质的代谢具有非常重要的影响， 作为白细胞减少症、原发性血小板减少性紫癜、功能性低热、脂肪肝、各种肝炎、冠状动脉硬化、心急梗塞等疾病的重要辅助药物,5.6 辅酶A的提取,分离过程：预处理提取除蛋白CMA树脂纯化LD-601大孔吸附剂二次纯化浓缩、沉淀、干燥 工艺过程中CoA的定性跟踪方法：硝基盐巯基显色法（CoA分子上的巯基能与亚硝基铁氰化物产生不稳定的强烈红色） 定量检测方法：磺胺乙酰化法和磷酸转乙酰化酶（PTA）紫外分光光度法 一般工艺制得的CoA制剂，有氧化型和还原型两种成分，磺胺乙酰化法测得的是制剂中CoA的总效价,5.8 从啤酒酵母中提取RNA,工业制取RNA主要从啤酒酵母、面包酵母、酒精酵母、白地霉和青霉菌等 以上菌株中的核酸大部分是RNA，而DNA的量很少，只要将菌体分离后经RNA抽提后即可废弃酵母泥提取核酸（即可增加经济效益，又可解决饲料酵母存在高核问题） 常用工业方法