氨基酸王镜岩生物化学全描述.ppt

第三章 氨基酸,Amino acid,三聚氰胺,概述氨基酸的应用,1.蛋白质的组成成分 2.医药工业,3.药物治疗,1，精氨酸：对治疗高氨血症、肝机能障碍等疾病颇有效果； 2，天冬氨酸：钾镁盐可用于恢复疲劳；治疗低钾症心脏病、肝病、糖尿病等。 3，半胱氨酸：能促进毛发的生长，可用于治疗秃发症；甲酯盐酸盐可用于治疗支气管炎等； 组氨酸：可扩张血管，降低血压，用于心绞痛，心功能不全等疾病的治疗。,4.化学工业,维生素B6:可采用丙氨酸或天冬氨酸为原料合成。 叶酸：需要用谷氨酸为原料合成。 氨基酸表面活性剂：酰基谷氨酸钠、十六烷基-L-赖氨酰-L-赖氨酸甲酯二盐酸、月桂酰-L-精氨酸乙酯盐酸等具有较强的抗菌杀菌活性，且无刺激性。 聚合氨基酸：聚谷氨酸甲酯可用于作为合成皮革的表面处理剂；聚天冬氨酸或聚谷氨酸的二烷基酯与磷酸高级烷基酯结合得到化合物可作为可塑剂，稳定剂等。,5.食品工业,谷氨酸钠味精； 天冬氨酸钠：可用于清凉饮料，能增加清凉感并使香味浓厚爽口； 天冬氨酰苯丙氨酸甲酯：甜味素APM,6.农业,杀虫剂：刀豆氨酸、5-羟色氨酸可使南方毛虫拒食而死；半胱氨酸可杀死黄瓜蝇；甘氨酸乙酯衍生的二硫代磷酸盐具有较强的杀蚜虫和杀螨效果； 杀菌剂：N-月桂酰缬氨酸可作为治疗稻瘟病；-1，4环己二烯丙氨酸能抑制黑穗病毒、稻瘟病等； 除草剂：如N-3,4二氮丙氨酸，硫代氨基酸酯等；,7.化妆品工业,氨基酸能调节皮肤pH的变动，对细菌的防护作用，也可作为皮肤、毛发的营养成分，增加皮肤、毛发的光泽。 防止皮肤干燥的自然保湿因子有甘氨酸、羟基丁氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、丝氨酸等游离氨基酸。 在化妆品中添加天冬氨酸或其衍生物以及一些维生素，可防止皮肤老化。,第一节 氨基酸 蛋白质的构件分子,一、蛋白质的水解,蛋白质可以被酸、碱或蛋白酶催化水解。在水解过程中，逐渐降解成相对分子质量越来越小的肽段，直到最后成为氨基酸的混合物。,(1) 酸水解,常用H2S04或HCl进行水解。一般用6molLHCl，4molLH2S04；回流煮沸20h左右可使蛋白质完全水解。,酸水解的优点：是不引起消旋作用，得到的是L氨基酸。 缺点：是色氨酸完全被沸酸所破坏，羟基氨基酸(丝氨酸及苏氨酸)有一小部分被分解，同时天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下来。,(2) 碱水解,一般与5molLNaOH共煮1020 h，即可使蛋白质完全水解。,水解过程中多数氨基酸遭到不同程度的破坏，并且产生消旋现象，所得产物是D和L氨基酸的混合物，称消旋物。 此外，碱水解引起精氨酸脱氨，生成鸟氨酸和尿素。 然而在碱性条件下色氨酸是稳定的。,(3) 酶水解,不产生消旋作用，也不破坏氨基酸。然而使用一种酶往往水解不彻底，需要几种酶协同作用才能使蛋白质完全水解。此外，酶水解所需时间较长。因此酶法主要用于部分水解。,它们主要用于蛋白质一级结构分析以获得蛋白质的部分水解产物。,二、氨基酸的一般结构,各种氨基酸的区别在于侧链R基的不同。,-氨基酸,可变部分,不变部分,第二节 氨基酸的分类,从各种生物体中发现的氨基酸已有180多种，但是参与蛋白质组成的常见氨基酸只有20种。,常见的蛋白质氨基酸：参与蛋白质组成的20种氨基酸。 不常见的蛋白质氨基酸：某些蛋白质中还存在若干种不常见的氨基酸，它们都是在已合成的肽链上由常见的氨基酸经专一酶催化的化学修饰转化而来的。 非蛋白质氨基酸：不参与蛋白质组成,呈游离或结合态的氨基酸,二十种常见蛋白质氨基酸的分类、 结构及三字符号,据R基团极性分类,极性R基团AA,非极性R基团 AA （种）,不带电荷（种）,正电荷（种） 负电荷（种）,非极性R基团氨基酸,不带电荷极性R基团氨基酸,带电荷R基团氨基酸,据R基团化学结构分类,脂肪族A （中性、含羟基或巯基、酸性、碱性）,芳香族A (Phe、Tyr、Trp),杂环 (His、Pro),甘氨酸 （Gly,G）,丙氨酸 （Ala,A）,缬氨酸 （Val,V）,亮氨酸 （Lue,L）,异亮氨酸 （Ile,I）,中性脂肪族氨基酸,含羟基或硫脂肪族氨基酸,丝氨酸 （Ser,S）,苏氨酸 （Thr,T）,半胱氨酸 （Cys,C）,甲硫氨酸 （Met,M）,酸性氨基酸及酰胺,天冬氨酸 （Asp,D）,谷氨酸 （Glu,E）,天冬酰胺 （Asn,N）,谷氨酰胺 （Gln,Q）,碱性氨基酸,赖氨酸 （Lys,K）,精氨酸 （Arg,R）,组氨酸 （His,H）,杂 环氨基酸,芳香族和杂环族,苯丙氨酸 Phe,酪氨酸 Tyr,色氨酸 Trp,脯氨酸 Pro,据氨基、羧基数分类,一氨基一羧基,一氨基二羧基(Glu、Asp),二氨基一羧基(Lys、His、Arg),据营养学分类,必需,非必需,必需氨基酸 Lys Trp Phe Val Met Leu Ile Thr 半必需氨基酸Arg、His,必需氨基酸：苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸 苏缬亮异亮，苯丙属芳香。 还有色赖蛋，缺一人遭殃。 半必需氨基酸：精氨酸、组氨酸是幼儿所必需的。,缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、色氨酸、苏氨酸用语言韵律记忆下来。 “借 一 两 本 淡 蓝 色 书” 缬 异 亮 苯 蛋 赖 色 苏,-氨基酸的通式,氨基酸的结构,甘氨酸 Glycine,脂肪族氨基酸,(氨基乙酸，不带电荷的极性R基),脂肪族氨基酸（中性）,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine,(氨基丙酸，非极性R基),甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine 缬氨酸 Valine,脂肪族氨基酸（中性）,(氨基甲基丁酸，非极性R基),甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine 缬氨酸 Valine 亮氨酸 Leucine,脂肪族氨基酸（中性）,(氨基甲基戊酸，非极性R基),甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine 缬氨酸 Valine 亮氨酸 Leucine 异亮氨酸 Ileucine,脂肪族氨基酸（中性）,(氨基甲基戊酸，非极性R基),丝氨酸 Serine,含羟基氨基酸,(氨基羟基丙酸，不带电荷的极性R基),丝氨酸 Serine 苏氨酸 Threonine,含羟基氨基酸,(氨基羟基丁酸，不带电荷的极性R基),甲硫氨酸 Methionine,含硫氨基酸,(氨基甲硫基丁酸，不带电荷的非极性R基),半胱氨酸 Cysteine,含硫氨基酸,(氨基巯基丙酸，不带电荷的极性R基),碱性氨基酸,精氨酸 Arginine,(氨基胍基戊酸，带正电荷的R基),碱性氨基酸,精氨酸 Arginine 赖氨酸 Lysine,（，二氨基己酸，带正电荷的R基）,碱性氨基酸(杂环),精氨酸 Arginine 赖氨酸 Lysine 组氨酸 Histidine,(氨基咪唑基丙酸，带正电荷的R基，是唯一一个R基的pKa值在7附近的氨基酸,也可划入不带电荷的极性AA),天冬氨酸 Aspartate,酸性氨基酸,（氨基丁二酸，带负电荷的R基）,天冬氨酸 Aspartate 谷氨酸 Glutamate,酸性氨基酸,(氨基戊二酸，带负电荷的R基),天冬酰胺 Asparagine,含酰胺氨基酸,不带电荷的极性R基,天冬酰胺 Asparagine 谷酰胺 Glutamine,含酰胺氨基酸,不带电荷的极性R基,芳香族氨基酸,苯丙氨酸 Phenylalanine,(氨基苯基丙酸，非极性 R基),芳香族氨基酸,苯丙氨酸 Phenylalanine 酪氨酸 Tyrosine,(氨基对羟苯基丙酸，不带电荷的R基),芳香族氨基酸,苯丙氨酸 Phenylalanine 酪氨酸 Tyrosine 色氨酸 Trytophan,(氨基吲哚基丙酸，非极性 R基),脯氨酸 Proline,亚氨基酸,(吡咯烷基羧酸),问题： 1、糖蛋白与脂蛋白的区别有哪些？ 2、哪几种AA参与糖肽键的形成？ 3、有一溶液在280nm有吸收峰，这溶液可能是什么？ 4、请写出三种碱性AA和两种酸性AA的三字母符号。,1、结构方面、组成方面、功能方面（共价的糖肽键与非共价键） 2、Thr Ser Hyl Hyp (O) Asn(N) Cys(S) Asp(O) 3、带有苯环的分子：蛋白质、核酸 、其他 4、 Lys His Arg Asp Glu,第三节 氨基酸的酸碱性质,一、离解性质,氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。 在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化。,根据酸碱质子理论： 酸是质子的供体，碱是质子的受体或接纳体,两性离子形式，净电荷为0，在电场中不移动,因此AA在水中的偶极离子（兼性离子）既起酸的作用，又起碱的作用，是一类两性电解质。,两性电离和等电点（重点）,pH值决定AA的带电情况，改变pH值就能改变其带电情况。,二、 氨基酸的等电点,调节氨基酸溶液的PH，使氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，所带净电荷为0。这一pH值即为氨基酸的等电点（isoe1ectrc point ），简称pI 。 在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。,PH =1 7 10 净电荷 +1 0 -1 正离子 两性离子 负离子 等电点PI,0H-,0H-,A+ A0 A- 第一步解离： Ka1=A0H+/A+ (1) 第二步解离： Ka2=A-H+/A0 (2),Ka1,Ka2,氨基酸等电点的计算,将Ka1和Ka2相乘，得： Ka1Ka2=H+2A-/A+ 等电点时，A+=A-,因此： H2= Ka1Ka2，两边取负对数，得 pI = (pKa1+pKa2) /2,A,B,标准氢氧化钠溶液进行滴定，以加入的氢氧化钠的摩尔数对pH作图，则得滴定曲线B段(图39)，在pH9.60处有一个拐点。 从甘氨酸的解离公式(2), Ka2=A-H+/A0可知，当滴定至甘氨酸的兼性离子有一半变成阴离子，即A0=A-时，则Ka2=H+，两边各取负对数得pKa2=pH，这就是曲线B段拐点处的pH 9.60。,如果用标准盐酸滴定，以加入的盐酸的摩尔数对pH作图，则得滴定曲线A段，在Ph2.34处有一个拐点。同样，从解离公式(1) Ka1=A0H+/A+ ，当滴定至甘氨酸的兼性离子有一半变成阳离子，即A0=A+ 时，则Ka1=H+，两边各取负对数得pKa1=pH，这就是曲线B段拐点处的pH 2.34 。,三、 等电点的利用 与计算,（1） 在等电点时，由于静电作用，氨基酸的溶解度最小，容易沉淀据此可测定氨基酸的PI；制备某些氨基酸,（2） 通过比较PH与PI，确定溶液带电性质,（3） 在同一PH下，不同氨基酸由于具有不同的PI，因此在溶液中带有不同的电荷，向两极移动的方向、速度不同，因而可通过层析、电泳等方法对混合氨基酸进行分离。,（4） 等电点的计算,PKI：羧基的解离常数的负对数 PK2：氨基的解离常数的负对数 PKR：R基团的解离常数的负对数,氨基酸虽然是一种两性电解质，既是酸又是碱，但是它却不能直接用酸、碱滴定来进行定量测定。这是因为氨基酸的酸、碱滴定的等电点pH或过高(1213)或过低(12)，没有适当的指示剂可被选用。然而向氨基酸例如甘氨酸溶液中加入过量的甲醛，用标准氢氧化钠滴定时，由于甲醛与氨基酸中的一NH2作用形成一NHCH20H，一N(CH20H)2等羟甲基衍生物(图311)而降低了氨基的碱性，滴定终点也移到pH 9附近。亦即酚酞指示剂的变色区域。,第四节 氨基酸的化学性质,生成的氮气(N2)只有一半来自氨基酸。,（1）与亚硝酸反应,用途：氨基酸的氨基也和其他的伯胺一样，在室温下与亚硝酸作用生成氮气，在标准条件下测定生成的氮气体积，即可计算出氨基酸的量。这是范斯来克法测定氨基氮的基础，此法可用于氨基酸定量和蛋白质水解程度的测定。这里值得注意的是：,（2）酰化反应,用途：用于多肽和蛋白质的人工合成中氨基的保护试剂，保护氨基以及肽链的氨基端测定（DNS法）等。P136,在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。 此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。,丹磺酰氯法（DNS）,用途：是鉴定多肽N-端氨基酸的重要方法。 Sanger 和 Edman （ P137）,（3）烃基化反应 （ 亲核取代反应）,2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。 在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。,苯异硫氰酸酯(PITC)法Edman试剂,多肽或蛋白质的末端氨基能与PITC(称Edman试剂)作用，生成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白质，后者在酸性有机溶剂中加热时，N末端的PTC氨基酸发生环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物并从肽链上掉下来，除去N末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的，经有机溶剂抽提干燥后，可用薄层层析、气相色谱和HPLC等进行鉴定。此方法还可以用来测定氨基酸序列。176页,Edman （苯异硫氰酸酯法）是一种N-端分析法，实际上也是氨基酸顺序的分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。,+,+,减少一个残基的肽,苯氨基硫甲酰多肽,无水酸水解,第一步偶联反应，第二步环化断裂反应，第三步转化反应：,ATZ,（4）脱氨基和转氨基反应,用途： 氨基酸氧化酶和转氨酶催化的反应。,2 -羧基参与的反应,氨基酸与碱作用生成相应的盐。氨基酸的碱金属盐能溶于水,而重金属盐则不溶于水。,（1）成盐反应,用途： 是合成氨基酸酰基衍生物的重要中间体。,（2）形成酯的反应,1,用途：使氨基酸羧基活化的一个重要反应，使它容易与另一个氨基酸的氨基结合，多肽合成中常用。,（3）形成酰卤的反应,用途：氨基酸的氨基通过酰化加以保护，羧基经酯化转变为甲酯，然后与肼和亚硝酸反应即变成叠氮化物。此反应使氨基酸的羧基活化。氨基酸叠氮化合物常用于肽的人工合成。,（4）叠氮化反应,1,用途：脱羧酶催化的反应。,（5）脱羧反应,3-氨基和羧基共同参与的反应,1,用途：常用于氨基酸的定性或定量分析。,茚三酮,水合茚三酮,(1)与茚三酮反应,生成紫色物质。 用纸层析或柱层析把各种氨基酸分开，利用茚三酮显色可以定性鉴定并用分光光度法在570 nm定量测定各种氨基酸含量。 两个亚氨基酸，脯氨酸和羟脯氨酸，与茚三酮反应并不释放NH3，而直接生成亮黄色化合物，最大光吸收在440nm。,（2）成肽反应,4、侧链基团的化学 性质,侧链基团的种类： 羟基、酚基、巯基（包括二硫键）、咪唑基、吲哚基、甲硫基、胍基、 非羧基、 非氨基,1、酪氨酸的酚基： （1）碘化和硝化：一碘酪氨酸、二碘酪氨酸（甲状腺素） （2）Pauly反应：与重氮化合物结合生成橘黄色的物质。 （3）米伦反应: Tyr与硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞反应，生成白色沉淀，加热后变红色。,2、 巯基（-SH）的性质,A：卤化烷、乙撑亚胺： 这些反应可用于巯基的保护。乙撑亚胺反应为胰蛋白酶水解肽链提供了一个新位点。,B：重金属 C：氧化作用 （1）一般氧化剂形成二硫化物,（2）强氧化剂（过甲酸）作用下形成磺酸基,二硫键断裂142页,强氧化剂作用下（过甲酸） 形成 还原剂作用下（巯基化合物） 形成,-SO3H,-SH,胱氨酸,3、精氨酸的胍基： Arg在NaOH中与1-苯酚和次溴酸钠反应，生成深红色，称为坂口反应(Sakaguchi反应) 。,第五节 氨基酸的光学性质 和光谱性质,除甘氨酸外，氨基酸均含有一个手性-碳原子，因此都具有旋光性。氨基酸的构型(指碳的构型)也和单糖一样以D甘油醛为参考物。,一、 氨基酸的旋光性,氨基酸的构型,从蛋白质的酸水解液或酶促水解液中分离获得的氨基酸都是属L型。但是D型氨基酸也在自然界中找到。 碱水解液中分离获得的氨基酸都是无旋光性的DL-消旋物。,苏氨酸、异亮氨酸，羟脯氨酸和羟赖氨酸除了碳原子是一个不对称碳原子外，还有第二个不对称碳原子。,胱氨酸的异构体：（P144） 1、D-胱氨酸 2、L -胱氨酸 3、内消旋胱氨酸,二、 氨基酸的光谱性质,构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm)均有光吸收。 在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。,酪氨酸的max275nm， 275=1.4x103; 苯丙氨酸的max257nm，257=2.0x102; 色氨酸的max280nm，280=5.6x103;,蛋白质由于含有这些氨基酸，所以也有紫外吸收能力，一般最大吸收在280 nm波长处，因此能利用分光光度法很方便地测定样品中蛋白质的含量。,分光光度法,分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术。此法具有灵敏度强，精确度高，操作简便，快速；对于复杂的组分系统，勿需分离即可检测出其中所含的微量组分的特点，因此分光光度法目前已成为生物化学研究中广泛使用的方法之一。,原理,有色溶液对单色光的吸收程度与溶液的浓度及液层厚度间的定量关系。关系符合朗伯比尔(LambertBeer)定律 。 有色物质的显色，是由于它对光线的吸收具有选择性。溶液呈现的颜色是它所吸收光色的互补色，吸收愈多，颜色愈深。,分光光度法定量分析所依据的是LambertBeer定律： A= log I0 /I = -logT=c l A：吸光度(absorbance)，也称光密度(OD) ：摩尔吸收系数，旧称摩尔消光系数 c：浓度(molL) l：吸收杯的内径或光程厚度(cm) I0：入射光强度 I：透射光强度 T：透光率,第六节 氨基酸混合物的分析分离,一、层析概述 即色层分析，也称色谱，是指利用混合物中各组分的物理，化学性质（分子形状，大小，分子极性，吸附力，亲和力，分配系数等）的不同，使各组分得到分离的技术。 所有的层析系统通常都有固定相和流动相两相组成,1、分配层析 2、凝胶层析 3、吸附层析 4、离子交换层析 5、疏水层析 6、亲和层析,按原理不同,按操作方式分为：,柱层析 纸层析 薄层层析,按流动相性质分为：,气相层析 液相层析,二、氨基酸混合物的分析分离常用方法,柱层析 纸层析 薄层层析 气相层析（色谱） 高效液相色谱（HPLC）,分配层析,离子交换层析,1. 分配层析,一、原理： 分配层析是利用混合物中各组分在互不相溶的两相之间的溶解度不同而予以分离的方法。,分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时溶质在两相溶剂中的浓度比值： 固定相中溶质的浓度 流动相中溶质的浓度,K=,A、纸层析 纸层析由于设备简单、操作方便、所需样品量少、分辨率一般能达到要求等优点而广泛用于物质的分离，并可以进行定性和定量分析。其缺点是展开时间较长。,(一) 原理 纸上层析实际上是以滤纸纤维的结合水为固定相，而以有机溶剂(与水不相混溶或部分混溶)作为流动相。展开时，有机溶剂在滤纸上流动，样品中各物质在两相之间不断地进行分配。由于各物质有不同的分配系数，移动速度因此不同，从而达到分离的目的。,溶质在滤纸上移动的速率可用Rf值表示： 溶质斑点中心的移动距离 溶剂前沿移动的距离 Rf值决定于被分离物质在两相间的分配系数以及两相间的体积比。由于在同一实验条件下，两相体积比是一常数，所以Rf值决定于分配系数。不同物质的分配系数不同，Rf值也不相同，由此可以根据Rf值的大小对物质进行定性分析。,Rf值 =,R f值（相对迁移率）,影响Rf值的因素有很多,除被分离组分的化学结构、样品和溶剂的pH值、层析中温度等外,流动相(展开剂)的极性也是一个重要因素。 展开剂极性大,则极性大的物质有较大Rf值,极性小的物质Rf值亦小,反之亦然 常用流动相的极性大小依次排列如下: 水甲醇乙醇丙酮正丁醇乙酸乙酯氯仿乙醚甲苯苯四氯化碳环己烷石油醚,层析时,流动相不应吸取滤纸中的水分,否则改变分配平衡,影响Rf值 所以多数采用水饱和的有机溶剂如水饱和的正丁醇,被分离物质的不同,选择的流动相也不同,（二）、层析的步骤： 1、层析介质的选择 2、点样 3、展层 4、检出和鉴定,纸层析是分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定， 将氨基酸混合物点在滤纸的一个角上，称原点。然后在密闭的容器中用一个溶剂系统(如丁醇乙酸)沿滤纸的一个方向进行展层。烘干滤纸后，旋转90。，再用另一个溶剂系统(如苯酚甲酚水)进行第二向层层。由于各种氨基酸在两个溶剂系统中具有不同的Rf值，因此就彼此分开，分布在滤纸的不同区域。当用茚三酮溶液显色时，得到一个双向纸层析谱 (图325)。,B、薄层层析,薄层层析是将作为固定相的支持剂均匀地铺在支持板(一般是玻璃板)上，成为薄层，把样品点到薄层上，用适宜的溶剂展开，从而使样品各组分达到分离的层析技术。 如果支持剂是吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酰胺等，则称之为薄层吸附层析； 如果支持剂是纤维素、硅藻土等，层析时的主要依据是分配系数的不同，则称之为薄层分配层析； 同理，如果支持剂是离子交换剂，则称为薄层离子交换层析；,薄层层析的操作与纸层析相似，但比纸层析速度快，一般仅需1530min，分辨力比纸层析高10100倍，它既能分离001ug的微量样品，又能分离500mg甚至更多的样品作制备用。薄层的制备可规格化，样品滴加后可立即展开，不受温度影响。其缺点是Rf值的重现性比纸层析差，对生物大分子物质的分离效果不大理想。,离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。 A、定义：是利用离子交换剂上的可解离基团(活性基团)对溶液中各种离子的结和力不同而达到分离目的的一种层析分离技术。,2. 离子交换层析,B、离子交换剂,母体：不溶性高分子。如纤维素、凝胶、树脂。琼脂糖、葡聚糖等 可解离基团：,酸性基团： -SO3H（SE强酸型）、COOH（CM弱酸型）也称阳离子交换剂 碱性基团： -NH2 （AE，弱碱型）， -N（CH3 ）2 （DEAE）， -N+（CH3）3（强碱型）、也称阴离子交换剂,阳离子交换剂 阳离子交换剂的电荷基团带负电，反离子带正电。如磺酸基(一S03H)，磷酸基(一P03H)，亚磷酸基(一PO2H)，羧基(一COOH)，酚羟基(一OH)等。 引入酸性基团的交换剂可离解出H+，可以与溶液中的正电荷化合物或阳离子进行交换反应。 根据电荷基团的强弱，又可将阳离子交换剂分为强酸型(带磺酸基团)、中强酸型(带磷酸基团或亚磷酸基团)和弱酸型(带羧基或酚基)三种。 RAH+Na+ = RANa+H+,阴离子交换剂 阴离子交换剂是在树脂中分别引入季胺一N+(CH3)3、叔胺一N(CH3)2、仲胺一NHCH3和伯胺一NH2基团构成的。当引入季胺和叔胺基团时，分别为强阴性和中强阴性离子交换剂。当引入仲胺和伯胺基团时，为弱阴性离子交换剂。 引入含氨基碱性基团的交换剂，可与OH结合后，与其他阴离子交换，属于阴离子交换剂。 R一N+(CH3)30H一十C1 = RN十(CH3)3C1 +OH,分离氨基酸混合物经常使用强酸型阳离子交换树脂。在交换柱中，树脂先用碱处理成钠型，将混合液(pH 23)上柱。在pH 23时，氨基酸主要以阳离子形式存在，与树脂上的钠离子发生交换“挂”在树脂上。 其亲和力主要决定于 A：它们之间的静电引力 B：氨基酸侧链与树脂之间的疏水相互作用,为了使氨基酸从树脂柱上洗脱下，需要降低它们之间的亲和力，有效的方法是逐步提高洗脱剂的pH和盐浓度(离子强度)，这样各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来。（洗脱顺序？） 目前已有全部自动化的氨基酸分析仪。,作业：P156第15题 （1）如果按照书上的要求能否有效地将五种AA洗脱下来？ （2）你能采用什么方法将五种AA洗脱下来？它们将按什么顺序被洗脱下来？,作业题： 某氨基酸溶液中，有四种氨基酸A、B、C、D，其等电点分别为10、4、7、5，如不考虑次要因素， 1）采用阳离子交换柱并用盐浓度或pH梯度进行洗脱，将按何种顺序被洗脱？ 2）采用阴离子交换柱并用盐浓度或pH梯度进行洗脱，将按何种顺序被洗脱？ 3)你能用什么办法将它们分离开来？,答案： 1、最先流出BDCA 2、最先流出ACDB,气相色谱法(gas chromatography，GC)是以气体作为流动相对混合组分进行分离分析的方法。它是50年代初期发展起来的一种高效、快速的分离分析技术。作为层析法的一个重要分支，在化学、化工、医药、卫生、食品和农业生产方面，都得到了广泛的应用。,3. 气相层析,一气相层析的分类 根据层析柱的形式可分成二大类。即填充柱气相层析和毛细管柱气相层析。 (1) 填充柱气相层析 它使用内径26mm的不锈钢柱或玻璃柱。根据柱中填充物的不同又可分为两类。即气固吸附层析和气液分配层析。 (2) 毛细管柱气相层析 它使用内径为0.10.6mm的不锈钢或玻璃毛细管。管壁涂有活性吸附剂的称为气固毛细管层析；管壁上涂有固定液或先涂固体再涂上一层固定液的称