《电泳技术复》PPT课件.ppt

电泳技术 刘松财 2011,本章的主要内容,一、概念 电泳（Electrophoresis）：在直流电场中，带电粒子向带符号相反的电极移动的现象称为电泳。,二、电泳分类 电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带电泳（有支持体）两大类。自由电泳法的发展并不迅速，因为其电泳仪构造复杂、体积庞大，操作要求严格，价格昂贵等。而区带电泳可用各种类型的物质作支持体，其应用比较广泛。区带电泳的分类如下：,1按支持物物理性状不同，可分为： (1)滤纸及其他纤维素膜如乙酸纤维膜、玻璃纤维膜、聚胺纤维膜电泳。 (2)粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳。 (3)凝胶电泳，如琼脂糖、琼脂、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳。 (4)丝线电泳，如尼龙丝、人造丝电泳。,2按支持物的装置形式不同，可分为： (1)平板式电泳，支持物水平放置，是最常用的电泳方式。 (2)垂直板式电泳。,3按pH的连续性不同，可分为： (1)连续pH电泳：电泳的全部过程中缓冲液pH保持不变。如纸电泳、乙酸纤维膜电泳。 (2)非(不)连续pH电泳：缓冲液与支持物之间有不同的pH，如聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳、等电聚焦电泳、等速电泳等，能使分离物质的区带更加清晰，并可作ng级微量物质的分离。,三、电泳的基本原理 电泳(Electrophoresis)是指带电荷的胶体粒子在电场作用下的定向移动现象。氨基酸、多肽、蛋白质和核酸等具有可解离基团，在溶液中能够形成带电荷的离子，不同物质由于带电性质不同，因而在一定电场强度下移动速度不同。不同的带电颗粒在同一电场中的泳动速度不同，常用迁移率或泳动速度表示。迁移率的定义为带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。,式中：m为迁移率(厘米/伏特秒)；v为颗粒的泳动速度(厘米/秒)；E为电场强度(伏特/米)；d为颗粒泳动的距离(厘米)；l为支持物的有效长度(厘米)，即载体与两极溶液交界面间的距离；V为实际电压(伏特)；t为通电时间(秒)。通过测量d、l、V，t便可计算出颗粒的迁移率。,带电颗粒在电场中的泳动速度与本身所带净电荷的量，颗粒大小和形状有关。一般说来，所带净电荷量愈多，颗粒愈小，愈接近球形，则在电场中的泳动速度愈快，反之则愈慢。泳动速度除了受颗粒本身性质的影响外，还和其它外界因素有关，它们之间的相互关系可用下式表示：,由上式可以看出泳动速度与电动电势(Z)、电场强度(E)及介质的介电常数(D)成正比，与溶液的粘度成（Cn）反比。式中C为一个常数，其数值为49 ，由颗粒大小所决定。,在正常情况下进行电泳时，胶体粘度，介电常数及电势梯度都在同一条件下，故胶体分子大小及其所带电荷多少，决定其泳动速度。由于样品中各种蛋白质的分子量不同，等电点不同，所带电荷多少亦不相同，在一定条件下各种蛋白质的泳动速度(迁移率)各异。,1.样品 带电颗粒本身的性质在几个方面影响着它的迁移率 (1)电荷：迁移率随着带电颗粒净电荷的增加而增加，电荷量的大小一般由pH决定。 (2)大小：对于较大的分子，由于周围介质所引起的摩擦力和静电引力的增加，迁移率下降。 (3)形状 同样大小，但具有不同形状的分子，如纤维状蛋白质和球状蛋白质，因摩擦力和静电引力的不同，而表现出不同的迁移率。,2.电场 根据实验的需要，电泳可分为两种，一种是常压电泳，电压在500伏特以下，分离时间较长。另一种是高压电泳，电压为1000伏特以上，电泳时间很短，有时仅需数分钟。常压电泳多用于分离蛋白质等生物大分子物质；高压电泳则多用来分离氨基酸、多肽、核苷酸、糖类等小分子物质。,欧姆定律表示了电流(A)、电压(V)和电阻()之间的关系：Av/ (1)电流 迁移率与电流成正比。带电颗粒迁移的距离与通电时间也成正比。电泳时必须保持电流的恒定。 (2)电压 电压控制着电流，因此迁移率与加在支持介质两端的电位差(端电压)成正比。 (3)电阻 迁移率与电阻成反比,3.缓冲液,(1)成分 (2)pH 溶液的pH值决定带电颗粒解离的程度，亦即决定其所带净电荷的多少。 (3)离子强度 一般最适的离子强度在0.020.2之间,4.电渗,电泳时，滤纸、醋酸纤维素薄膜等支持物在缓冲液中都带有负电荷，而与这些支持物接触的水溶液则带正电荷(静电吸引)。电泳时，由于滤纸、醋纤膜等固定不动，于是带正电荷的水就流向负极，并携带颗粒也起向负极移动。由于电渗现象与电泳作用同时存在，当电泳方向与电渗方向致时，其蛋白迁移的距离等于两者相加之和；若两者方向相反时，则颗粒的泳动距离为电泳的距离减去电渗的距离。,凝胶电泳的支持介质：,固体支持介质可以分两类：一类是纸、醋酸纤维素薄膜、硅胶、纤维素等。这些介质相对来说是化学惰性的，能将对流减到最小。另一类是淀粉、琼脂糖和聚丙酰胺凝胶。这些凝胶介质不仅能防止对流，扩散最小，而且它们是多孔介质，孔径大小与生物大分子具有相似的数量级，因而具有分子筛的作用。因而在进行分离时不仅取决于分子的电荷密度，还取决于分子的大小。,聚丙烯酰胺是通过丙烯酰胺和N、N-亚甲双丙烯酰胶在适当的游离基催化加速制作用下聚合而成的。催化加速剂一般是0.10.3(W/V)的过硫酸铵与0.10.3(W/V)的-二甲氨基丙腈(DMAP)或N，N，N，N-四甲基乙二胺(TEMED)。凝胶的孔径由丙烯酰胺单体和交联剂N，N-亚甲双丙烯酰胺的相对比例决定。,一般来说，不同分子量的蛋白质，在聚丙烯酰胺凝胶电泳中所选择的凝胶浓度不同，详见下表。,电泳的操作过程,(1)支持介质的饱和 (2)加样 (3)样品的分离 (4)取出支持介质 (5)染色和物质的回收,几种染科,1氨基黑10B 氨基黑10B C22H13O12N6S3Na3，MW=715，max=620nm-630nm。氨基黑是酸性染料，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐,氨基黑染不同蛋白质的着色度不等、色调不一(有蓝、黑、棕等),2考马斯亮蓝R250 C45H44O8H3S2Na，MW=824，max=560nm-590nm。染色灵敏度比氨基黑高5倍。,3考马斯克蓝G250 比考马斯亮蓝R250多二个甲基。 MW854，max=5,90nm-610nm。染色灵敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体，能选择地染色蛋白而几乎无本底色,4银染色 银染的机制是将蛋白带上的硝酸银离子还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。银染的灵敏度高，可以检测低于1 ng的蛋白质。,四、电泳技术的应用,生物分子纯度鉴定 蛋白质分子量的测定 蛋白质等电点的检测 蛋白质的鉴定 蛋白质组学 核酸检测及序列测定,实验五 人工合成牵引丝蛋白基因在原核细胞及Pichia 酵母细胞中的表达研究,生物分子纯度鉴定,蛋白质的鉴定,1 2 3 4 5 6 7,kDa 43.0 31.0 20.1 500,图8 Western blot 检测目的蛋白在酵母细胞中的表达情况 Fig. 8 Western blot of the expressed products from pPICZC- nSp Lane 12：Induced supernatant of pPICZC- Sp transformant； 34：Induced supernatant of pPICZC- 2Sp transformant； 56：Induced supernatant of pPICZC- 4Sp transformant； 7：Low molecular weight protein marker.,实验三 蜘蛛牵引丝蛋白Spidroin2 cDNA重组酵母表达质粒的构建及其在Pichia酵母细胞中的表达,Fig 2.3 Digestion with EcoR I and Xho I 1: pET-Lep M: DL-2000 marker,Fig 2.2 Identification of PCR 1: Lepin M: DL-2000 marker,瘦蛋白原核表达载体的酶切与PCR鉴定,实 验 二 瘦蛋白基因在原核细胞中的表达及多克隆抗体的制备,Fig 2.5 SDS-PAGE of leptin inclusion bodies, leptin after purification and refolding. M: Low molecular weight protein standard weight; 1: protein after refolding; 2: purified protein; 3: inclusion bodies; 4: bacterial proteins; 5: control,97kDa 43kDa 20kDa,M 1 2 3 4 5,包涵体蛋白的纯化、复性,实 验 二 瘦蛋白基因在原核细胞中的表达及多克隆抗体的制备,+,pH 3,pH 7.5,pH 10,2-D Electrophoresis,The 1st D: Iso