微生物实验实验一显微镜的使用及微生物形态观察.ppt

微生物实验,实验一 显微镜的使用及微生物形态观察 实验二 活性污泥生物相及藻类形态观察 实验三 微生物的染色 实验四 微生物细胞数的计数 实验五活性污泥不同微生物种群的分离培养与鉴别,1-1,实验一 显微镜的使用及微生物形态观察,一. 目的 1. 了解普通光学显微镜的构造，学习显微镜的使用方法和保养。（高、低倍镜的使用） 2. 观察蓝细菌、霉菌、酵母菌、放线菌的个体形态，学会生物图的绘制。 二. 实验器材 1. 光学显微镜 2. 示范片：颤藻、曲霉、青霉、酵母菌、放线菌。,1-2,三. 实验内容 (一) 显微镜的构造和使用方法 1. 构造 机械部分: 镜筒(双筒，两筒间距离可调，上装有目镜） 转换器（3孔，装有物镜） 载物台（中央圆孔、弹簧夹、移动器） 调节器（粗调、细调） 镜臂（支撑作用） 镜座（上有光源，亮度可调） 光学部分：目镜（10、16） 物镜（低倍镜10、高倍镜40、油镜100） 聚光器（内有光圈调节） 光源（光量可调）,1-3,显微镜放大倍数 = 目镜放大倍数 物镜放大倍数 物镜上的标识： 1 .25 (0.65、0.25) 100(40、10） 160 / 0.17 数值孔径 放大倍数 镜筒长 盖玻片厚度 数值孔径： N.A. = ns i n / 2 n 玻片和物镜之间的折射率。 光线最大射入角。 分辨率（最大可分辨距离）/ N.A. 波长,1-4,2. 显微镜的使用 低倍镜的使用 （1）双手取出显微镜置于实验台上，接上电源，打开开关，调节合适光量。 （2）转动转换器，将低倍镜移至正下方。调节两目镜镜筒间的距离。 （3）将载玻片放在载物台上夹住，移动观察对象于圆孔正中。 （4）侧视物镜，转动粗调将载物台上移，至载玻片距物镜头约时停止。 （5）双眼向目镜里观察，同时旋转粗调节器使载物台缓慢下移，若标本显出但不清晰，可用细调节器调至清晰。若粗调旋转太快，超过焦点没有看到标本，则必须重复（4）、 (5)步骤。不能在眼睛观察目镜的同时旋转粗调，以防物镜与载玻片相碰撞，造成损坏。,1-5,高倍镜的使用 在用低倍镜找到观察目标后，若需要进一步放大观察，将其移到视野中央。用转换器将高倍镜移到镜筒下方，将光量调大一点。若标本不清晰，用细调上下转动使之清晰。（此时不再动粗调） 显微镜的维护 （）将载物台降至最低，取下标本片。 （）将光量调至最小，关上电源。 （）用镜头纸先檫目镜、物镜，再擦显微镜其它部分。 （）将显微镜放入镜箱，还原。,1-6,（二）微生物形态的观察 1. 用低倍镜和高倍镜观察颤藻、曲霉、青霉、酵母菌、放线菌、星藻示范片。 2. 画出微生物形态图，并标明显微镜的放大倍数。,10 10 颤藻,2-1,实验二 活性污泥生物相的观察,一. 目的 1.学习测量微生物大小。 2.学习用压滴法制作标本片。 3. 观察几种原、后生动物，菌胶团及藻类个体形态。 二. 实验器材 1. 活性污泥混合液。 2. 单胞藻、新月藻、草履虫等示范片。 3. 显微镜、载玻片、盖玻片。 4. 目测微尺、物测微尺。,2-2,三. 实验内容,1. 微生物大小的测定 (1) 标定目镜测微尺 装在目镜上的目测微尺中央刻有等分为100格或更多格的标尺，使用前要用物测微尺标定。物测微尺中央刻有1mm长的标尺，等分为100格，10m格。将物测微尺的刻度朝上放在载物台上，用低倍镜找出物测微尺的刻度，移动物测微尺使其第一条线与目测微尺的第一条线重合，顺着刻度线找出另一条重合线。算出低倍镜下目测微尺每格的长度。换高倍镜用同样方法标定出高倍镜下目测微尺每格的长度。,2-3,测微尺示意图,(2) 微生物大小的测量 将物测微尺取下，换上标本片，选择适当物镜测量微生物的长度和宽度占目测微尺的格数，再按目测微尺1格的长度算出微生物的长度和宽度。,2-4,2.压滴法观察活性污泥中生物相 （1）压滴法制作标本片 用滴管取活性污泥混合液一小滴，放在载玻片中央。取一块盖玻片先将一边与混合液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在混合液上。片内不能有气泡。 （2）观察活性污泥中生物相 先用低倍镜观察活性污泥中菌胶团、原生动物、后生动物。画出所观察到的生物形态图。标明名称、放大倍数和微生物的大小。,2-5,四.实验结果 1.低、高倍镜下目测微尺每格的长度。 2.画出23种污泥中所观察到的生物形态图。标明名称、放大倍数和微生物的大小。 3.画出两种藻类生物形态图，标明名称、放大倍数和微生物的大小。 。,3. 观察几种藻类的个体形态 观察几种藻类的个体形态，画出生物形态图，标明名称、放大倍数。,3-1,实验三 微生物的染色,一. 目的 1. 学习微生物的染色技术，掌握微生物的单染色法和革兰氏染色法。 2. 学习油镜的操作。,二染色原理和油镜的工作原理,1油镜工作原理 油镜的放大倍数最大（100），故镜头焦距短，直径小,但所需光照强度却最大。从标本片透过的光线是从玻片进入空 气，再进入镜头。由于玻璃和空气的介质密度不同，有些光会 因折射或反射而 不能进入 镜头。物象就显 现不清。 为了不使通过的 光线有 所损失，须在油镜与玻片 之间加入折射率和玻璃 (n=1.52）相仿的香柏油 (n=1.515)。故而称之为 “油镜”。,3-2,2单染色法： 微生物不但个体微小，且无色半透明。要在显微镜下观察清楚，必须染上颜色 。微生物细胞中含有大量的蛋白质等一类两性电解质：在酸性溶液中结合质子带正电；在碱性溶液中给出质子而带负电。等电点一般在pH=25。所以，在中性、碱性或弱酸性溶液中，微生物细胞通常带负电荷。碱性染料在电离时，染色部分是带正电荷的，容易与带负电荷的菌体结合使之着色。经染色后的菌体细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下很容易观察。,3-3,3革兰氏染色法： 革兰氏染色法将细菌分为G和G- ，这由两类细菌细胞壁的结构和组成的不同而决定。用结晶紫初染后，所有的细菌都染上蓝紫色。碘作为媒染剂能与结晶紫结合形成结晶紫-碘的复合物，增强了染料与菌体的结合力。用乙醇脱色处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。G细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，且壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色时使细胞壁脱水、网状结构孔径缩小，通透性降低，使得结晶紫碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内。虽经洗脱和复染仍然保持初染剂的蓝紫色。G-细菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以在脱色处理时，类脂被乙醇溶解，细胞壁的通透性增大，使结晶紫碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的颜色。,3-4,三实验器材 1显微镜、香柏油、接种环、酒精灯等。 2结晶紫染液、碘液、95%乙醇、沙黄染液。 3菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。,3-5,四实验内容,(一) 单染色 1涂片 取一块载玻片，用记号笔划分出两区域并做上记号，在两区域中央各滴半滴无菌水，用接种环以无菌操作法分别取两种菌种在左右两滴水中，和匀后涂成薄膜。 2干燥 室温自然干燥或吹干。 3固定 涂面朝上，通过火焰23次。 4染色 在涂片薄膜上滴加结晶紫染液，使之覆盖2分钟。 5水洗 傾倒去染液，斜置载玻片，用洗瓶小水流沿玻片边缘冲洗，直至水呈无色为止。 6干燥 室温自然干燥或用吸水纸吸干。,3-6,(二)革兰氏染色 完成单染色的16步骤后 7. 媒染 加媒染剂碘液使之覆盖1分钟，水洗，吸水纸吸干。 8. 脱色 滴加95% 乙醇数滴使之覆盖16秒钟，立即水洗,吸干。 9. 复染 用沙黄（番红）液复染 2 分钟，水洗，吸干。,(二) 镜检 先分别用低倍镜和高倍镜找到要观察的样品区域后，用转换器将物镜转到空挡，在样品区域滴加香柏油，再将油镜慢慢转到工作位置浸入油中。若不清晰，慢慢转动微调直至清楚。 油镜用完后，用镜头纸沾取乙醇-乙醚混合液檫拭油镜头。再用干的镜头纸檫干镜头。,3-7,五实验结果 观察两种细菌的形态和颜色，绘出油镜下细菌形态图，说明革兰氏染色的结果。 六思考题,通过实验，你认为革兰氏染色成功关键是那一步？为了避免假阳性或假阴性出现，在对未知菌种做革兰氏染色鉴定时，你认为应该怎样做？,4-1,实验四 微生物的计数 （显微镜直接计数法）,一目的 1.了解血球计数板的计数原理，掌握血球计数板的计数方法。 2.观察酵母菌的形态，学习区分酵母菌死活细胞的方法。 二. 实验器材 显微镜、血球计数板、酵母菌液、美蓝染液、盖玻片。,4-2,三原理 1. 血球计数板计数原理,血球计数板是一块特制的载玻片，有四条竖槽和一条横槽。横槽两边的平台上各有一个有九个大方格的方格网，中间大方格为计数室：边长为，深为0.1mm，容积为0.1mm3(10-4ml)。计数室有两种规格：一是分为16个中方格，每中方格中有25个小方格；另一种是分为25个中方格，每中方格有16个小方格。两种都共有400个小方格。,4-3,计数： 数出5个中方格中的总菌数A，若菌液的稀释倍数为B，则计算公式如下：,(1) 25个中方格的计数板计算公式 (2) 16个中方格的计数板计算公式,2. 区分酵母菌死活细胞基本原理 美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型是无色。用美蓝对酵母菌的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变成无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的或淡蓝色，而死细胞或代谢作用的衰老细胞则呈蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。,四. 实验内容,1. 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别 (1) 在载玻片上加半滴美蓝染液，在染液上滴一滴菌液。取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下盖在菌液上。 (2) 将标本片放3分钟后，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。,4-4,2. 酵母菌液的计数,(1) 镜检计数室 对计数板进行镜检。若有污物，则用自来水冲洗，用电吹风吹干后 才能 进行计数。 (2) 加样品 在血球计数板上盖上盖玻片, 用滴管将摇匀的酵母菌液由盖玻片边的小槽滴一小滴,菌液会自动进入计数室，静置5分钟。 (3) 计数 将血球计数板置于载物台上，先用低倍镜找到计数室的位置，再换高倍镜计数。每计数室计5个中格（四角和中间）。计数原则：计上不计下，计左不计右。芽体占母细胞一半时算一个。 (4) 清洗血球计数板 计数后将血球计数板用自来水冲洗干净，勿用硬物刷，吹干后镜检。若不干净，则必须重复洗涤干净为止。,4-5,五. 结果记录 1.,2.酵母菌死活细胞的比例？ 六. 思考题 用此法计数的结果是活菌体还是死、活菌体的总和？,5-1,实验五活性污泥不同微生物种群的分离培养与鉴别,一. 目的 1掌握配制培养基和制备无菌水的方法。 2. 学会玻璃器皿的干热灭菌和培养基高压蒸汽灭菌技术。 3. 学习倒平板的方法和两种分离微生物的基本操作技术。 4. 学习微生物纯种分离、培养及菌落的观察。,二. 实验器材,1.培养皿、试管、吸管、锥形瓶等。 2.牛皮纸等包扎材料。 3. 10% HCl、10% NaOH、精密pH试纸。 4. 牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂。 5. 高压蒸汽灭菌锅等。 6. 活性污泥。 7接种环、酒精灯、恒温箱(培养箱)等。 8结晶紫染液。 9. 显微镜、载玻片,5-2,三. 实验内容,（一）培养基的制备及灭菌 1. 玻璃器皿的包扎与灭菌 （1） 六套培养皿一组, 用报纸包装。 （2） 取四支吸量管，在其吸端塞少许棉花后用长报纸条包扎。 （3） 干热灭菌:上述玻璃器皿在160C烘箱内2小时。 2.无菌水的制备 在3支试管中各装入9ml自来水，塞上硅胶塞, 同下述培养基一起用高压蒸汽灭菌。,5-3,3. 培养基的制备, 称量：牛肉膏 蛋白胨 NaCl 琼脂 自来水 0.75g 1.5g 0.75g 3g 150ml 溶化：用烧杯在电炉上将上述各物依次溶解，注意补充水。 调pH值： 溶液稍冷后用pH试纸、10% NaOH或10%HCl 调整溶液 的 pH在7.6左右。 分装：试管4支各装其高度1/5的溶液，其余溶液装锥形瓶。 加塞包扎 ：锥形瓶加棉塞并用牛皮纸包扎。 湿热灭菌 ： （高压蒸汽灭菌）1.05kg/cm2(103kPa)、 121灭菌 20min。 搁置斜面： 试管培养基冷至50时斜搁使斜面长度不 超过试管一半。,6-1,（二）微生物的分离、培养及形态观察,1. 平板划线分离法,(1) 倒平板: 将融化并冷至50的细菌培养基倒约1520ml于无菌培养皿中，立即放在桌上轻轻转动使之均匀。冷后成平板。（3个） (2) 划线：在火焰旁，左手拿平板，右手拿接种环，取一环菌液（原污水）在平板上划线。常用的方法有如下三种： 划线完毕后 盖上皿盖，倒置 于37恒温箱中 培养48小时后观 察结果。,6-2,2.稀释平板分离法 (1) 取样 (2) 稀释水样 以无菌操作按十倍稀释法用无菌吸量管和无菌水将10-3倍的水样稀释至10-4、10-5、10-6倍。 (3) 平板制作 将三套无菌培养皿编号，将上述三种浓度的水样各吸0.5ml 于相应的培养皿中。加热融化培养基，待其冷至约45时以无菌操作倾注1015ml 入培 养皿中，马上将培养皿平 放桌上 轻轻转 动使之混合均匀， 冷却后 成平板。 倒置，于 37培 养48小时后观察 结果。,10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6,6-4,3菌落形态特征的观察,观察平板上菌落的形态、结构、大小、菌落高