流式细胞术分析及应用.ppt

1,流式细胞术分析及应用,2,流式细胞术的原理 流式细胞术的应用 流式细胞术的数据处理 流式细胞术的样品制备,主 要 内 容,流式细胞仪(Flow Cytometer):是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。 流式细胞术(Flow Cytometry):利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分析和分选（纯度可达99%以上）的技术。,3,一、流式细胞术的原理,现代流式细胞仪包括,液流系统 聚焦细胞以供检测 光学系统 激发和收集光信号 电子系统 将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计算机分析,4,液流系统,液流系统将样本悬液聚焦在光源的中心处,5,Sample Flow in Optical Cuvette,6,Sample,Laminar Flow,Low Sample Flow Rate 12 mL/min,Sheath,Sheath,Sample,Laminar Flow,Sheath,Sheath,Optical Cuvette,High Sample Flow Rate 60 mL/min,样品和鞘液流,7,8,Injector Tip,Fluorescence,signals,Focused laser,beam,Sheath fluid,流式细胞仪的光学系统,激光 (Laser)是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光照。 激光波长: 台式机为固定波长488nm, 635nm ，大型机波长谱线宽包括 325， 457.9，488, 514.5，520.8，530.9，568.3， 633，647 nm 光收集系统是由若干组透镜，滤波片，小孔组成，将产生的光信号引导至检测器。,9,流式细胞仪的光信号,散射光信号 荧光信号,10,11,1. 散射光信号,前向角散射光（FSC, Forward Scatter） 入射激光的同向散射光信号 细胞相对大小及其表面积。 侧向角散射（SSC, Side Scatter） 入射激光90角的散射光信号 细胞粒度及细胞内相对复杂性。,前向角散射光 FSC,12,侧向角散射光SSC,13,散射光,散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异 - 通常使用“散点图”来看散射光信号 - 散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据,14,散点图Dot Plot,15,lysed whole blood,2. 荧光信号,荧光素吸收激光能量 荧光素将吸收能量释放，转换为 振动能和热能 释放较入射光波长更长的光量子 荧光素与特异抗体结合 荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强,16,Fluorochrome specification,17,18,Compensation,二、流式细胞术的应用,细胞表型分析 胞内蛋白的检测 细胞周期分析 细胞因子测定 分选 细胞内钙离子测量 ,19,1.细胞表型分析,20,21,2.胞内蛋白的检测,22,3. 细胞周期的检测,23,CFSE（羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂）,24,4.细胞凋亡的检测,25,26,1、荧光信号的面积：对荧光光通量进行积分 2 、DNA指数(DI)：相对DNA含量= 样品G0/G1细胞DNA含量平均数 标准二倍体DNA量的平均数 3、异倍体：非二倍体，包括近二倍体、四倍体、多倍体、非整倍体,凋亡细胞的特点,在形态上，早期细胞核固缩，染色体边集在核膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折卷曲，但早期细胞膜的完整性未受到破坏 凋亡细胞的FSC降低，SSC增加。 细胞坏死时，细胞肿胀， FSC增大，SSC也增大,27,Annexin V Assay,28,29,Annexin V/PI双染 活细胞为（Annexin V-/PI-） 坏死细胞为（Annexin V+/PI+） 凋亡细胞（Annexin V+/PI-）,Annexin V Assay-能够区分死亡与凋亡,30,31,5、细胞因子测定,+,+,Antigen (cytokines),Fluorescence Detector antibody,Capture beads,Capture antibody,Beads,32,Beads Provide a Flexible Platform,Multiple sizes,Beads provide an expandable assay platform for use with a flow cytometer,Different intensities,Different colors with different intensities,33,Multiplexed Beads,Shades of a color,Antibody coupled beads, emitting at distinct FL3 intensities,Various analytes,Antibody coupled PE label, emitting at FL2 intensity proportional to analyte conc.,34,Example 6-bead assay,Capture Beads,Lysate or Supernatant Sample,Detector Antibodies,35,CBA Standard curves,6、细胞分选,36,37,细胞分选,38,三、流式细胞数的数据处理,39,40,41,42,43,44,45,compensation,46,分析软件,47,常用软件 FlowJo,48,Gating,49,50,51,52,四、流式细胞术的样品制备,单细胞悬液，避免任何细胞沉积 被检细胞或颗粒大小0.240um 样品中至少20000个细胞，浓度105-106个/毫升,53,抗体的选择,首选直接标记抗体 荧光分子 PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原 间接标记：效果有时不太好,54,实验对照的设计,空白对照： 阴性对照：常用同型抗体对照 单色分析：设同型抗体对照 多色分析：同型对照，单阳性对照（单标） 同型对照(Isotype)：使用与抗体相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于检测由于抗体非特异性结合而产生的背景染色。 阳性对照：检测阴性时,55,表面分子检测样品制备,将细胞样本制成单细胞悬液，注意悬液内不能有粘集，团块，尽量避免多的细胞碎片。 调整细胞浓度为5104-1105个，用PBS洗两次，用100ulPBS重悬细胞。 加入适量Fc受体阻断剂（与抗体匹配的动物的血清或IgG），4避光放置30分钟。 加入适量的特异性表面标记荧光抗体或独特型对照抗体，4避光放置30分钟。 用PBS洗两遍，用200ul固定液重悬细胞，上机检测。,56,胞内分子检测的样品制备,收集细胞，调至1106细胞/毫升。 4%固定液重悬细胞，常温或4避光放置3