体外培养的准备与操作要点研究生课程.ppt

第二章、动物细胞培养的要求、培养的准备与操作要点,江青艳,华南农业大学动物科学学院,一、细胞在体外生长的要求,环境要求：包括温度、pH值、气体、渗透压等； 营养要求：天然培养基与合成培养基,温度：不同来源的细胞，其培养的最适温度不同。例如，昆虫及鱼类细胞25-28度，哺乳动物细胞一般为37-38度； 细胞对低温的耐受力比高温强。温度不低于0 时，虽影响细胞代谢，但并无伤害作用；再把细胞置于2535 时，细胞仍能生存和生长，但速度减慢。若温度过低，在降到冰点以下时，细胞因胞外水和胞质结冰而受损死亡。 若向培养液中加入甘油或二甲基亚砜等，封入冻存管，置于液氮中，细胞可耐受70 以下温度，能长期储存，解冻后细胞复苏，仍能继续生长增殖，生物性状不受影响。,1、细胞培养的环境要求,细胞在3940 培养1h，能受到一定损伤，但仍有可能恢复，但不能忍受温度再升高2 ，持续数小时，即在4142 中培养1h，细胞损伤严重，温度至43 以上时细胞多数被杀死。 高温主要引起酶的灭活、类脂质破坏、核分裂的破坏，产生凝固酶使细胞发生凝固，另外是蛋白质变性。,pH值：动物细胞培养最适pH值为7.2-7.4，低于6.8或高于7.6均对细胞产生严重影响，甚至导致细胞死亡； 一般原代培养的细胞对pH值要求严格，细胞系对 一定范围的pH值改变有抵抗力。细胞对碱性不如对酸性的变化耐受，偏酸的条件比偏碱的环境对细胞生长有利。 随细胞数量的增多、代谢加强，释放CO2增多，使pH 降低。为了维持培养基恒定的pH ，多在培养基中加入磷酸盐等缓冲剂。 实际工作中，一般在培养液中加入羟乙基哌嗪乙硫磺酸（Hepes）：该物质对细胞无毒性，也不起缓冲作用，主要作用是防止pH迅速变动，在开瓶通气培养或活细胞观察时能维持较恒定的pH值。,气体：细胞在培养初期对溶氧要求较少，但在快速增殖（对数增长期或指数增长期）要求有较多的溶氧。采用开放式培养时（碟皿或培养瓶松盖培养或培养板培养），一般要把细胞置于95空气加5二氧化碳的混合气体环境中。 渗透压：培养液的渗透压一般保持在与体液相同的水平，对细胞较为适宜。例如，生理盐水或平衡盐溶液。,2、细胞培养的营养要求,天然培养基：来自动物的体液或组织液，早期广泛采用。例如：血清、组织浸出液等； 优点：符合细胞生长的要求； 缺点：成分不确定，来源复杂、有限，不能做到标准化。,合成培养基：根据动物的体液成份和细胞生长的需要，由各种营养物质组合而成，如MEM、DMEM、RPMI1640等。 优点：能够标准化生产； 缺点：不能完全满足细胞生长与增殖的需要。因此，在培养时，一般在培养液中加入一定量（10-15%）的血清，为细胞提供促贴壁因子或促生长因子。,血 清,血清的种类 胎牛血清：剖腹产的胎牛 新生牛血清：出生24h之内的新生牛 小牛血清：出生1030d的小牛 （人血清、马血清、羊血清） 血清的主要作用：提供基本营养物质，提供贴壁和扩展因子（FN、LN），提供激素及各种生长因子（FGF、EGF、PDGF)，提供结合蛋白，对培养中的细胞提供某些保护作用等。,血清的使用与储存,使用前的处理：56灭活30min 去除补体成分 储存条件：灭活后分装成小包装（10mL、20mL、50mL），20 储存；使用前4 融化。 使用浓度：一般为520，最常用的是10。 使用血清的缺陷：在实验研究中采用血清，可能对研究结果带来干扰，因此，许多研究采用无血清培养。,二、细胞培养的准备,实验室的布局 仪器设备的准备 实验用品的准备,1、实验室布局,洗涤间：实验用品的清洗、干燥与消毒 准备间：试剂配制、大动物的取材（传递窗） 缓冲间：更换鞋、帽与工作服 无菌室：操作区与观察区,2、仪器设备的准备,超净工作台：用于组织取材、细胞分离、换液、细胞处理等 二氧化碳培养箱：使用前必须进行调试（温度调试、气体含量测试）与消毒。 倒置生物显微镜（配置摄像与拍照系统）：用于细胞观察与拍照。 离心机：用于细胞分离、纯化等。 其他常规设备：纯水器、干燥箱、蒸气消毒设备、称量设备、水浴箱、冰箱、液氮罐等。,CO2培养箱,2.1 主要设备,倒置生物显微镜,转壁式生物反应器（RWVB),2.1 主要设备,高压蒸汽消毒锅,3、实验用品的准备,手术器械的准备与消毒：包括手术刀、剪、镊子等，多采用高压蒸气消毒。 玻璃器皿的准备与消毒：包括刻度离心管、三角瓶、玻璃吸管、培养皿等，经酸液浸泡、清洗干燥后，多采用干热灭菌。 培养板与培养瓶：多采用一次性塑料制品。 细胞计数室与微量移液器,常用培养基的配制：DMEM，RPMI1640，199，Ham F12等，按产品说明书配制。 培养液的过滤除菌：采用微孔滤膜（0.22um 或0.45um)过滤除菌。 其他培养用液的准备：如Hanks液、PBS、生理盐水等，采用高压灭菌 。 细胞消化用液：胰蛋白酶液、胶原酶液、透明质酸酶液等配成母液后，经微孔滤膜过滤除菌后，小量分装，低温保存。 血清的灭活、过滤与保存：小牛血清、胎牛血清。,二、细胞培养的操作要点,1、总体要求,牢固树立无菌观念：任何与细胞接触的物品与液体均引起污染，污染导致前功尽弃！ 培养一丝不苟的工作作风：每一项准备工作和每一步操作都必须做到严格、细致。,2、消毒,无菌室的消毒 培养箱的消毒与更换二氧化碳气体 超净台的消毒 缓冲间的消毒 实验用品的消毒 污染的处理,3、取材与细胞分离,取材原则与方法：尽量选择幼龄动物，在局部清洗、消毒后取材。 细胞分离：采用机械剥离、剪碎、酶消化、细胞分离（过筛）与纯化（离心分离）等步骤。 酶消化法的要点：酶浓度、温度、消化时间。 细胞成活率检测：染料排斥法（台盼兰染色） 细胞密度检测：采用细胞计数室。,4、细胞培养与观察,细胞培养：将细胞用含10-15%血清的培养液重悬，接种在培养器皿中，置入培养箱内培养，并跟踪观察。 更换培养液：半量换液 细胞处理：如采用外源性物质处理，观察其对细胞形态与功能的影响，或细胞固定与染色等。 细胞观察：观察贴壁与生长情况，确定换液与处理时间。,5、细胞传代,对悬浮类细胞，采用吹打法收集细胞，直接传代； 对贴壁类细胞，采用酶消化法收集细胞，经清