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选考部分 现代生物科技专题第一讲基因工程(一)基因工程的基本工具1.已知限制酶EcoR和Sma识别的碱基序列和酶切位点分别为GAATTC和CCCGGG，判断下图中两种限制酶切割DNA后产生的末端及其种类产生的是黏性末端；产生的是平末端。2.判断下图所示过程需要的工具酶是限制酶；是DNA连接酶。3.连线载体须具备的条件及其作用1.图解基因工程的三种操作工具2.明辨与DNA有关的酶比较项目限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶DNA(水解)酶作用底物DNA分子DNA分子片段脱氧核苷酸DNA分子DNA分子作用部位磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对间的氢键磷酸二酯键形成产物黏性末端或平末端形成重组DNA分子新的DNA分子形成单链DNA游离的脱氧核苷酸(二)基因工程的基本操作程序4.目的基因的获取(1)目的基因：主要指编码蛋白质的基因，也可以是一些具调控作用的因子。(2)5.基因表达载体的组成及作用3.识记基因工程操作的“四步曲”(二)基因工程的基本操作程序6.连线不同种类的受体细胞与目的基因导入的常用方法7.结合抗虫棉的培育过程填空(1)从图中可以看出，目的基因是Bt毒蛋白基因，使用的载体是Ti质粒，将目的基因表达载体导入受体细胞的方法是农杆菌转化法。(2)请写出两种检测目的基因是否表达的方法：抗原抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫。4.谨记基因工程的理论基础(1)构建基因表达载体的基础：DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。DNA分子都遵循碱基互补配对原则。DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。(2)外源基因在受体细胞内表达的基础：基因是控制生物性状的遗传单位。遗传信息的传递都遵循中心法则。生物界共用一套遗传密码。5.明确启动子起始密码子，终止子终止密码子启动子和终止子位于DNA片段上，分别控制转录过程的启动和终止；起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。6.掌握目的基因检测与鉴定的方法示意图(三) 基因工程的应用和蛋白质工程8.填写蛋白质工程流程图中字母代表的含义A.转录，B.翻译，C.分子设计，D.氨基酸序列，E.预期功能。9.判断有关叙述的正误(1)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中()(2)由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用()(3)蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质()(4)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构()7.图解蛋白质工程的三个方面8.有关基因工程应用的三点提醒(1)用基因工程生产的药品，从化学成分上分析都应该是蛋白质类。(2)动物基因工程的实施主要是为了改善畜产品的品质，不是为了产生体型巨大的个体。(3)并非所有个体都可作为乳腺生物反应器，制备乳腺生物反应器通常是针对雌性个体进行的操作。基因工程的操作工具命题点1限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作用1(2017镇江一模，多选)下列有关基因工程相关工具的叙述，正确的是()A限制酶能识别并切割DNA任意序列 BDNA连接酶与Taq酶作用位点不同 C没有与目的基因重组的质粒也可以进入受体细胞 D使用质粒运载体可以避免目的基因在受体内被分解解析：选CD 限制酶具有专一性，一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，而不能任意切割DNA分子，A错误；DNA连接酶与Taq酶作用位点相同，都是磷酸二酯键，B错误；没有与目的基因重组的普通质粒也可以进入受体细胞，所以需要检测，C正确；若直接将目的基因片段导入受体细胞，则很容易被分解失效，使用质粒运载体是为了将目的基因导入受体细胞，避免目的基因被分解，D正确。2(2016全国卷)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR、BamH和Sau3A三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoR、Sau3A的切点是唯一的)。GAATTCGGATCCGATCCTTAAGCCTAGGCTAG图(a)根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)经BamH酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被_酶切后的产物连接，理由是_。(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有_，不能表达的原因是_。(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有_和_，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_。解析：(1)由题图可知，BamH和Sau3A两种限制性内切酶的共同识别序列是，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此经BamH酶切得到的目的基因可以与图(b)所示表达载体被Sau3A酶切后的产物连接。(2)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能顺利地转录，再完成翻译过程，即顺利表达。图中甲所示的目的基因插入在启动子的上游，丙所示目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录，因此目的基因不能表达。(3)常见的DNA连接酶有EcoliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。答案：(1)Sau3A两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(2)甲和丙甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录(3)Ecoli DNA连接酶T4DNA连接酶T4DNA连接酶拓展归纳DNA连接酶连接两个DNA片段，催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键；DNA聚合酶是把游离的脱氧核苷酸连接到引物或者已有的DNA单链上，催化形成磷酸二酯键。命题点2载体的作用及特点3某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH酶切后，与用BamH酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有_(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_；并且_和_的细胞也是不能区分的，其原因是_。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有_的固体培养基。(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于_。解析：(1)质粒作为载体，应具备的基本条件有：有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入其中；在受体细胞中能自我复制，或能整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制；有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择等。(2)在培养基中加入氨苄青霉素进行筛选，其中未被转化的大肠杆菌和仅含环状目的基因的大肠杆菌，因不含氨苄青霉素抗性基因而都不能在此培养基上存活，二者不能区分。含有质粒载体的大肠杆菌和含有插入了目的基因的质粒的大肠杆菌中都含有氨苄青霉素抗性基因，都能在此培养基上存活，二者也不能区分。若要将含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌进一步筛选出来，还需要使用含有四环素的固体培养基。(3)某些噬菌体经改造后作为载体，导入受体细胞后，其DNA复制所需的原料来自于受体细胞。答案：(1)能自我复制、具有标记基因(答出两点即可)(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长含有质粒载体含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长四环素(3)受体细胞归纳拓展标记基因的标记原理载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力，当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如下图所示：基因工程的基本操作程序命题点1目的基因获取的方法1(2017苏州一模，多选)下图表示通过cDNA过程获得目的基因并利用PCR扩增过程的示意图。据图分析，下列有关叙述错误的是()A催化过程的酶是RNA聚合酶B过程不需要DNA解旋酶C过程需要两个相同的引物D催化过程的酶都是DNA聚合酶，均需耐高温解析：选ACD催化过程的酶是逆转录酶；过程中DNA在高温下解旋，不需要解旋酶；过程需要两种引物；催化过程的酶都是DNA聚合酶，但过程中DNA聚合酶需要耐高温。拓展归纳PCR技术的原理和反应过程(1)PCR原理：DNA复制原理，即：(2)PCR反应过程：过程说明图解变性当温度上升到90 以上时，双链DNA解聚为单链复性温度下降到50 左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合延伸72 左右时，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使DNA新链由5端向3端延伸(3)结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中的缓冲液完成的。2(2014海南高考)下图是将某细菌的基因A导入大肠杆菌内，制备“工程菌”的示意图。据图回答：(1)获得A有两条途径：一是以A的mRNA为模板，在_酶的催化下，合成互补的单链DNA，然后在_的作用下合成双链DNA，从而获得所需基因；二是根据目标蛋白质的_序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测其DNA的_序列，再通过化学方法合成所需基因。(2)利用PCR技术扩增DNA时，需要在反应体系中添加的有机物质有_、_、4种脱氧核糖核苷三磷酸和耐热性的DNA聚合酶，扩增过程可以在PCR扩增仪中完成。(3)由A和载体B拼接形成的C通常称为_。(4)在基因工程中，常用Ca2处理D，其目的是_。解析：(1)利用逆转录法合成目的基因的过程是：以mRNA为模板，在逆转录酶的催化作用下合成单链DNA，然后在DNA聚合酶作用下，合成双链DNA分子；根据蛋白质工程合成目的基因的过程是：根据目标蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测DNA中脱氧核苷酸的排列顺序，再通过化学方法合成。(2)PCR过程中需要酶、底物、模板、引物和能量等条件。(3)目的基因和运载体结合，形成基因表达载体。(4)在利用大肠杆菌作受体细胞时，需要先用Ca2处理，使之成为感受态细胞，有利于吸收重组DNA分子。答案：(1)逆转录DNA聚合酶氨基酸脱氧核苷酸(2)引物模板(A基因)(3)基因表达载体(4)使其成为感受态细胞，有利于吸收重组DNA分子拓展归纳几种获取目的基因方法的比较方法从基因文库中获取人工合成从基因组文库中获取从部分基因文库，如cDNA文库中获取化学合成法逆转录法过程3(2018东台模拟)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，沿海滩涂盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐碱基因培育出了耐盐碱水稻新品系。请据图回答下列问题：限制酶AlaEcoRPstSma切割位点表2几种限制酶识别序列及切割位点表(1)获取真核生物的基因通常采用人工合成法，通过图示中方法合成的耐盐碱基因中是不含_的，如果要将耐盐碱基因和质粒重组，应该在基因两侧的A和B位置除了接上以上两个结构外，还需分别加入EcoR和_限制酶识别序列，这样设计的优点是避免质粒和目的基因自身环化以及定向连接。(2)过程采用PCR技术扩增目的基因时，在PCR反应体系的主要成分中应该包含：扩增缓冲液(含Mg2)、水，4种脱氧核糖苷酸、模板DNA、TaqDNA聚合酶和引物I和引物，若在该反应体系中，目的基因扩增了4代，则共用了引物I_个。(3)请画出Pst限制性核酸内切酶切割DNA形成黏性末端的过程_。(4)图示中将基因表达载体构建完成后没有直接导入农杆菌，而是先将其导入大肠杆菌，目的是_。(5)在步骤过程中都需用_处理两类细菌。为了确认目的基因通过过程导入植物细胞中后是否成功表达，通常从分子水平进行检测的方法是用_法。(6)假设该抗盐碱基因D，通过基因工程导入水稻后连接到水稻的一条染色体上，则该水稻进行减数分裂的细胞在联会时有_个D基因。解析：(1)获取真核生物的基因通常采用人工合成法，通过图示中方法合成的耐盐碱基因中是不含启动子和终止子的，如果要将耐盐碱基因和质粒重组，应该在基因两侧的A和B位置除了接上以上两个结构外，还需分别加入EcoR和Sma限制酶识别序列。(2)若在该反应体系中，目的基因扩增了4代，共形成2(241)30个DNA分子单链，则共用了引物I是30/215个。(3)Pst限制性核酸内切酶切割DNA形成黏性末端的过程图：(4)图示中将基因表达载体构建完成后先将其导入大肠杆菌，目的是获取大量重组质粒或让目的基因扩增。(5)在步骤过程中都需用Ca2处理两类细菌。为了确认目的基因通过过程导入植物细胞中后是否成功表达，通常采用抗原抗体结合法进行检测。(6)假设该抗盐碱基因D，通过基因工程导入水稻后连接到水稻的一条染色体上，则该水稻进行减数分裂的细胞在联会时，由于DNA复制导致有2个D基因。答案：(1)启动子和终止子Sma(2)15(3)(4)获取大量重组质粒(让目的基因扩增)(5)Ca2抗原抗体结合(6)2命题点2基因表达载体的构建4(2016天津高考)人血清白蛋白(HSA)具有重要的医用价值，只能从人血浆中制备。下图是以基因工程技术获取重组HSA(rHSA)的两条途径。(1)为获取HSA基因，首先需采集人的血液，提取_合成总cDNA，然后以cDNA为模板，使用PCR技术扩增HSA基因。图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。(2)启动子通常具有物种及组织特异性，构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体，需要选择的启动子是_(填写字母，单选)。A人血细胞启动子B水稻胚乳细胞启动子C大肠杆菌启动子 D农杆菌启动子(3)利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是_。(4)人体合成的初始HSA多肽，需要经过膜系统加工形成正确空间结构才有活性。与途径相比，选择途径获取rHSA的优势是_。(5)为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与_的生物学功能一致。解析：(1)要想合成总cDNA，需要采集人的血液获得总RNA。由于DNA的复制只能从脱氧核苷酸单链的5端向3端延伸，因而引物均应结合在DNA单链的3端，而DNA的两条链反向平行，由此可以确定引物在另一条脱氧核苷酸单链的位置和方向。(2)若要从水稻胚乳细胞内获得目的产物，需要控制该目的基因只在水稻胚乳细胞内表达。由题干中的信息“启动子通常具有物种及组织特异性”可知，此处需要选择水稻胚乳细胞启动子。(3)酚类物质能吸引农杆菌，因此在水稻受体细胞中添加该类物质，能吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因的成功转化。(4)途径和的主要区别是途径的受体细胞是真核细胞，途径的受体细胞是原核细胞。由于人体合成的初始HSA多肽需要经膜系统加工形成正确的空间结构才有生物活性，所以选择途径获取rHSA更具有优势。(5)rHSA是基因工程的产物，其是否具有医用价值，还需要在个体水平上进一步确认其与HSA的生物学功能是否一致。答案：(1)总RNA(或mRNA)(2)B(3)吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因成功转化(4)水稻是真核生物，具有膜系统，能对初始rHSA多肽进行高效加工(5)HSA拓展归纳限制酶的选择原则(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类：应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst。不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择Sma。为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst和EcoR两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类：所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保具有相同的黏性末端。质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶Sma会破坏标记基因。基因工程的应用和蛋白质工程命题点1基因工程的应用1(2017南京三模)在应用农杆菌侵染植物叶片获得耐旱基因植株的实验步骤中，不需要的是 ()A将耐旱基因导入农杆菌并通过农杆菌侵染植物叶片细胞B利用标记基因和选择培养基的作用，筛选导入耐旱基因的细胞C用PEG诱导转基因细胞的原生质体融合后培养出愈伤组织D将转基因幼苗栽培在干旱环境中以检验植株的耐旱性解析：选C 应用农杆菌侵染植物叶片获得耐旱基因植株时，需要将耐旱基因导入农杆菌并通过农杆菌侵染植物叶片细胞；利用标记基因和选择培养基的作用，筛选导入耐旱基因的细胞；该过程不涉及细胞融合，不需要使用PEG；将转基因幼苗栽培在干旱环境中，在个体水平检验植株的耐旱性。命题点2蛋白质工程2(2015全国卷)已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的_进行改造。(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰_基因或合成_基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括_的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：_。(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过_和_，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物_进行鉴定。解析：(1)蛋白质的功能由蛋白质的三维结构决定，而蛋白质的三维结构与氨基酸序列有关，因此，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的氨基酸序列进行改造。(2)P基因与P1基因的根本区别是碱基序列不同，因此可以通过对P基因进行修饰获得P1基因，也可以直接合成P1基因。中心法则的内容可以通过下图体现：(3)蛋白质工程的基本途径：从预期的蛋白质功能出发设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)。答案：(1)氨基酸序列(或结构)(其他合理答案也可)(2)PP1DNA和RNA(或遗传物质)DNARNA、RNADNA、RNA蛋白质(或转录、逆转录、翻译)(3)设计蛋白质的结构推测氨基酸序列功能拓展归纳蛋白质工程与基因工程的比较项目蛋白质工程基因工程区别原理中心法则的逆推基因重组操作起点预期的蛋白质功能目的基因操作核心改造基因基因表达载体的构建区别过程获取目的基因构建基因表达载体将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定实质定向改造或生产人类所需蛋白质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品(基因的异体表达)结果生产自然界没有的蛋白质生产自然界已有的蛋白质联系蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程，因为要对现有蛋白质进行改造或制造新的蛋白质，必须通过基因修饰或基因合成来实现高考真题集中研究找规律1(2014江苏高考，多选)下列关于基因工程技术的叙述，错误的是()A切割质粒的限制性核酸内切酶均特异性地识别6个核苷酸序列BPCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应C载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因D抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达解析：选ABC限制性核酸内切酶大多是特异性地识别6个核苷酸序列，但也有少数限制性核酸内切酶能识别4个、5个或8个核苷酸序列；PCR反应中耐高温的DNA聚合酶只是在延伸阶段发挥催化作用；载体质粒上抗生素抗性基因可作为标记基因，供重组DNA的鉴定和选择，而不是抗生素合成基因；目的基因导入受体细胞后不一定都能正常表达。2(2017江苏高考)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：(1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过_获得_用于PCR扩增。(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的_位点。设计引物时需要避免引物之间形成_，而造成引物自连。(3)图中步骤1代表_，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。(4)PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏_的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但_的引物需要设定更高的退火温度。(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有_(填序号：升高退火温度降低退火温度重新设计引物)。解析：(1)PCR技术可在体外对DNA进行扩增，模板可以是mRNA经过逆转录获得的cDNA。(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)时，需在引物中增加适当的限制性核酸内切酶(限制酶)的识别序列，便于目的基因与质粒的连接。为了避免引物自连，设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对。(3)根据PCR的过程可知，图中步骤1代表变性，步骤2代表退火(复性)，步骤3代表延伸，这三个步骤构成一个循环。(4)退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，过高的退火温度会破坏引物与模板的碱基配对。因为G、C之间的氢键数多于A、T之间的氢键数，故GC含量高的引物需要设定更高的退火温度。(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物，可能的原因是退火温度过高使扩增效率降低，也可能是未按照目的基因两端的核苷酸序列来设计引物，因此可以采取的措施是降低退火温度、重新设计引物等。答案：(1)逆转录cDNA(2)限制性核酸内切酶(限制酶)碱基互补配对(3)变性(4)引物与模板GC含量高(5)3(2016江苏高考)下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：限制酶BamHBclSau3AHind识别序列及切割位点 图1图2(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用_两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过_酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于_态的大肠杆菌。(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加_，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中_。(3)若BamH酶切的DNA末端与Bcl酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为_，对于该部位，这两种酶_(填“都能”、“都不能”或“只有一种能”)切开。(4)若用Sau3A切图1质粒最多可能获得_种大小不同的DNA片段。解析：(1)基因工程中选择合适的限制酶切割质粒和目的基因时，应保留目的基因和至少一个标记基因结构的完整性，即遵循“目的基因切两侧，标记基因留一个”的基本原则，最好选择切割产生不同末端的两种限制酶同时切割质粒和目的基因，以避免目的基因的反向插入带来的不正常表达，因此据图分析应选择的限制酶为Bcl和Hind，切割后质粒上保留的四环素抗性基因作为标记基因。酶切后的载体和目的基因通过DNA连接酶的作用形成重组质粒，重组质粒需要导入Ca2处理后的处于感受态的大肠杆菌(处于感受态的大肠杆菌细胞膜的通透性大大增加，便于重组质粒进入)。(2)由上述分析可知，为了筛选出导入重组质粒的大肠杆菌，应先配制含四环素的选择培养基，平板上长出的菌落为导入普通质粒或重组质粒的大肠杆菌菌落，进一步鉴定出导入重组质粒的大肠杆菌，可利用PCR扩增的方式，结合电泳技术来分析处理。DNA的两条链是反向平行的，在PCR过程中，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶只能从引物的3端延伸DNA链，因此应选择引物甲和引物丙。(3)因为Bcl和BamH酶切产生的黏性末端相同，所以可以被DNA连接酶连接，连接部位的6个碱基对序列为，但是连接后形成的DNA中不再具有Bcl和BamH的识别序列，连接部位不能被这两种酶切开。(4)由图可知，能被限制酶Bcl和BamH切割的序列也能被Sau3A识别并切割，因此图中质粒上存在3个Sau3A的切割位点，若将3个切割位点之间的DNA片段分别编号为a、b和c，则完全酶切(3个切割位点均被切割)会产生3种大小的DNA片段，即为a、b和c；考虑只切1个切割位点，有三种情况，都产生一种大小的DNA片段，即大小均为abc；考虑切2个切割位点，则会产生ab、c、ac、b、bc、a几种不同大小的DNA片段。综上所述，若用Sau3A识别并切割图中质粒，最多可获得7种大小的DNA片段，即为abc、ab、ac、bc、a、b、c。答案：(1)Bcl和Hind连接感受(2)四环素引物甲和引物丙(3)都不能(4)74(2015江苏高考)胰岛素A、B链分别表达法是生产胰岛素的方法之一。下图1是该方法所用的基因表达载体，图2表示利用大肠杆菌作为工程菌生产人胰岛素的基本流程(融合蛋白A、B分别表示半乳糖苷酶与胰岛素A、B链融合的蛋白)。请回答下列问题：图2(1)图1基因表达载体中没有标注出来的基本结构是_。(2)图1中启动子是_酶识别和结合的部位，有了它才能启动目的基因的表达；氨苄青霉素抗性基因的作用是_。(3)构建基因表达载体时必需的工具酶有_。(4)半乳糖苷酶与胰岛素A链或B链融合表达，可将胰岛素肽链上蛋白酶的切割位点隐藏在内部，其意义在于_。(5)溴化氰能切断肽链中甲硫氨酸羧基端的肽键，用溴化氰处理相应的融合蛋白能获得完整的A链或B链，且半乳糖苷酶被切成多个肽段，这是因为_。(6)根据图2中胰岛素的结构，请推测每个胰岛素分子中所含游离氨基的数量。你的推测结果是_，理由是_。解析：(1)基因表达载体中应具有启动子、目的基因、终止子、标记基因和复制原点。(2)启动子是转录过程中RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能启动目的基因的表达。图中的氨苄青霉素抗性基因充当了标记基因，可用含有氨苄青霉素的培养基筛选含有重组质粒的大肠杆菌。(3)构建基因表达载体时，需要用同种限制酶分别切割目的基因和载体，然后用DNA连接酶将目的基因和载体连接。(4)胰岛素肽链上具有蛋白酶的切割位点，会导致胰岛素被菌体内的蛋白酶降解，而通过融合表达将切割位点隐藏在内部可防止胰岛素的A、B链被菌体内的蛋白酶降解。(5)根据溴化氰能切断肽链中甲硫氨酸羧基端的肽键，并结合半乳糖苷酶被切成多个肽段，获得了完整的胰岛素A链、B链这一信息，可以推测半乳糖苷酶中必然含有多个甲硫氨酸，胰岛素A链、B链不含甲硫氨酸。(6)每一条肽链的两个末端分别含有一个氨基和一个羧基，某些氨基酸的R基中也含有氨基，因此含两条肽链的胰岛素中至少含有2个游离的氨基。答案：(1)终止子(2)RNA聚合作为标记基因，将含有重组质粒的大肠杆菌筛选出来(3)限制酶和DNA连接酶(4)防止胰岛素的A、B链被菌体内蛋白酶降解(5)半乳糖苷酶中含多个甲硫氨酸，而胰岛素A、B链中不含甲硫氨酸(6)至少2个两条肽链的一端各有一个游离的氨基，氨基酸R基团中可能还含有游离的氨基调研试题重点研究明趋势一、选择题1(2017无锡一模)下列有关基因工程的叙述，正确的是()A限制性核酸内切酶只在获得目的基因时使用B重组质粒的形成是在细胞内完成的C目的基因必须整合到受体细胞的DNA中才能复制D通过基因工程育种可以定向地改造生物的遗传性状解析：选D构建基因表达载体时用同种限制酶切割目的基因和质粒；重组质粒的形成是在细胞外完成的，然后再导入受体细胞；重组质粒上有复制原点，不整合到受体细胞的DNA中也可复制；由于目的基因是已知基因，可以定向地改变生物的遗传性状。2限制性内切酶Hind 和Xho 的识别序列及切割位点分别为AAGCTT和CTCGAG，下列相关叙述正确的是()A两种限制酶的识别序列在DNA分子中出现的概率不同B两种限制酶切割形成的黏性末端都是AGCTC分别用这两种酶切割目的基因和质粒后能形成重组质粒D实验中可通过控制反应时间、酶的浓度等控制酶切效果解析：选D限制性核酸内切酶Hind和Xho的识别序列均为6个脱氧核苷酸，所以在DNA中出现的概率相同，均为1/46；两者切出的黏性末端分别为AGCT和TCGA；由于黏性末端不同，故用两种酶切割目的基因和质粒后不能形成重组质粒。3用限制酶EcoR、Kpn和二者的混合物分别降解一个1 000 bp(1 bp即1个碱基对)的DNA分子，降解产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，降解产物分开，凝胶电泳结果如下图所示。该DNA分子的酶切图谱(单位：bp)正确的是()解析：选C根据限制酶Kpn切割后，降解产物只有一种，推测该DNA分子是环状DNA，且只有1个Kpn识别位点。根据限制酶EcoR切割后，降解产物为200 bp和800 bp，推测该DNA分子上有2个EcoR识别位点。再根据限制酶EcoR和Kpn混合切割，得到200 bp和400 bp两种片段，确定选项C的图谱是合理的。4(2017泰州一模)将经过扩增的DNA和质粒用相同的限制酶进行如下图所示的切割，电泳得到纯净的B片段和D片段，将两种片段置于适宜的缓冲液中用DNA连接酶处理。如果只考虑两个片段的环状连接，则能形成不同核苷酸序列的环状DNA的种类是()A6种B3种C2种 D1种解析：选A只考虑两个片段的环状连接，能形成的环状DNA有B片段与B片段同向连接的、B片段与B片段反向连接的、D片段与D片段同向连接的、D片段与D片段反向连接的、B片段与D片段同向连接的及B片段与D片段反向连接的，共6种。5(2017扬州一模)下列关于核酸分子杂交和抗原抗体杂交的叙述，正确的是()A核酸分子杂交是指两条脱氧核苷酸链的杂交B抗原抗体杂交的原理为碱基互补配对原则C核酸分子杂交可检测目的基因的存在和转录D抗原抗体杂交常以目的基因产物作为抗体解析：选C核酸分子杂交可以是两条脱氧核苷酸链的杂交，也可以是 DNA单链和RNA的杂交；抗原抗体杂交的原理是抗体能与对应的抗原发生特异性结合；核酸分子杂交可检测目的基因的存在和转录；抗原抗体杂交中目的基因产物常作为抗原。6(2018启东中学段考)如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用效果的顺序，正确的是()ABC D 解析：选A是将一个DNA切成互补的两个黏性末端，由限制性内切酶发挥作用；DNA聚合酶是在DNA复制时发挥作用，是DNA复制；DNA连接酶是将两个DNA片段连接在一起()；解旋酶是将DNA分子双链解旋成两条互补的单链()。7(2018海安期中)从某海洋动物中获得一基因，其表达产物为一种抗菌体和溶血性均较强的多肽P1。目前在P1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的多肽药物，首先要做的是()A合成编码目的肽的DNA片段B构建含目的肽DNA片段的表达载体C依据P1氨基酸序列设计多条模拟肽D筛选出具有优良活性的模拟肽作为目的肽解析：选C已经获得该目的基因片段，不需要合成编码目的肽的DNA片段，A错误；需要构建含目的肽的DNA片段的表达载体，但这不是第一步，B错误；蛋白质工程的第一步是根据蛋白质的功能，设计P1氨基酸序列，从而推出其基因序列，C正确；该基因表达产物为一种抗菌体和溶血性均较强的多肽P1，目前在P1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的多肽药物，而目的多肽是抗菌性强但溶血性弱，所以必需对其改造，保持其抗菌性强，抑制其溶血性，D错误。8(2018泰兴期中)微生物常被用于基因工程中。下列相关叙述正确的是()A从耐热的细菌中获取PCR所需的DNA连接酶B大肠杆菌、酵母菌等是基因工程常用的载体C作为载体的DNA分子需具有合成抗生素的基因D常利用土壤农杆菌将目的基因导入植物细胞解析：选D从耐热的细菌中获取PCR所需的DNA聚合酶，A错误。基因工程中常用的载体是质粒、动植物病毒、噬菌体的衍生物，B错误。作为载体的DNA分子需要有抗生素抗性基因，便于后期的筛选，C错误。常利用土壤农杆菌将目的基因导入到双子叶植物细胞中，D正确。9下面为利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是()A的构建需要限制性核酸内切酶和DNA聚合酶参与B侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到的染色体上C的染色体上若含抗虫基因，则就表现出抗虫性状D只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异解析：选D构建重组质粒需要用到限制性核酸内切酶和DNA连接酶，不需要DNA聚合酶；含重组Ti质粒的农杆菌侵染植物细胞后，重组Ti质粒的TDNA整合到受体细胞的染色体上，而不是重组Ti质粒整合到受体细胞的染色体上；导入受体细胞的目的基因表达后，转基因植株方能表现出相应性状，若目的基因在受体细胞中不表达，转基因植株不能表现出相应性状；表现出抗虫性状则表明该植株细胞发生了基因重组，基因重组是可遗传变异。10(2017南京三模)根据某基因上游和下游的碱基序列，设计合成了用于该基因PCR的两段引物(单链DNA)。引物与该基因变性DNA(单链DNA)结合为双链DNA的过程称为复性。下图是两引物的Tm(引物熔解温度，即50%的引物与其互补序列形成双链DNA分子时的温度)测定结果，下列叙述错误的是()A通常引物1和引物2不能有碱基互补配对关系B两引物分别是子链延伸的起点，并可以反复利用C若两引物的脱氧核苷酸数相同，推测引物2的GC含量较高D复性所需温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度等因素解析：选B引物1和引物2不能有碱基互补配对关系，以免二者结合，A正确；两引物参与形成子链，不能反复利用，B错误；若两引物的脱氧核苷酸数相同，引物2的熔解温度较高，推测GC含量较高，C正确；综上所述，复性所需温度与时间取决于引物的长度、碱基组成及其浓度等因素，D正确。11(2018南通模拟，多选)科学家利用基因工程技术将鱼的抗冻蛋白基因导入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高。在培养转基因番茄的过程中，下列操作合理的是()A可用PCR技术或逆转录法获得抗冻蛋白基因B利用选择性培养基对构建的基因表达载体直接筛选C利用农杆菌转化法将基因表达载体导入番茄体细胞D在低温条件下筛选已导入抗冻蛋白基因的番茄植株解析：选ACD利用逆转录法可获得cDNA；构建的基因表达载体不可以直接在选择培养基上进行筛选，需要先导入受体细胞中再进行筛选；农杆菌转化法是目的基因导入受体细胞的常用方法；利用低温条件对耐寒番茄进行个体性状水平的检测，筛选出耐寒番茄植株。12(2017南通三模，多选)科研人员先分别PCR扩增尿酸酶基因和原核生物胞外蛋白信号肽基因(编码的肽链能引导新合成的蛋白质转移、分泌)，再将它们拼接形成融合基因，并导入大肠杆菌生产尿酸酶。相关叙述正确的是()A扩增两类基因时可以通过设计引物来控制两类基因的拼接方向B构建融合基因的目的是使大肠杆菌能合成尿酸酶并分泌到细胞外C融合基因导入大肠杆菌前需构建基因表达载体，以保证目的基因正常表达和遗传D在导入融合基因前，应先用NaCl处理大肠杆菌，使其变为感受态细胞解析：选ABC 每个基因的两端都有启动子和终止子，它会调节基因的表达，因此扩增两类