经典一组织培养技术.ppt

组织培养技术,硕士研究生选修课程系列,Tissue culture,2,绪 论,组织培养技术 绪 论,3,这是一个真核细胞模型 Can you describe it?,4,原核细胞与真核细胞比较,5,一、基本概念,组织培养 tissue culture 从体内取出组织模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。 使用组织块（O.51立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米）,6,细胞培养 Cell Culture 方法同上，培养物是单个细胞或细胞群。,7,器官培养 Organ Culture 应用和组织培养相似的条件，培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。 使用器官原基或器官的一部分或整个器宫,8,动物细胞培养用容器及培养基 Culture vessels and medium for animal cell culture,体外培养 in vitro 细胞培养 Cell culture 组织培养 Tissue culture 器官培养 Organ culture,体外培养种类,9,二、发展史,德国人Roux（1885）用温生理盐水体外培养鸡胚组织并存活数月被认为是组织培养的萌芽试验。 1903年Jolly用盖片悬滴培养法，培养蝾螈白细胞生活一月，提示组织或细胞离体后，在人工培养条件下，仍能生存。 1907年Harrison创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法，在无菌条件下，采用淋巴液作培养基，培养蛙胚神经组织生活了数周，并曾观察到神经细胞凸起的生长过程。由此建立了体外培养组织和细胞的基本模式系统。 1923年，Carrel设计了卡式瓶培养法，扩大了组织的生存空间。,10,1924年Maximow的双盖片培养法，使之更易于传代和减少污染。 1957年Dulbecco 等采用胰蛋白酶消化处理和应用液体培养基的方法，获得了的单层细胞培养，单层培养成了组织培养普遍应用的技术。促进了细胞系(cell line)的建立。 近年各种条件已商品化系列化，应用冷冻技术，各国建立细胞库,组织培养发展示意图,11,我国组织培养的发展,20世纪30年代传入我国。 20世纪50年代起步 20世纪70年代，成为医学和生物学研究中普遍应用的手段。 近20年，建立了人和各种动物肿瘤及其他细胞系，细胞培养库已初步建成，细胞培养用品，培养剂、学清、试剂等已商品化。 高科技的引入和开展，各种培养用具不断被引入，电镜技术、标记技术、单细胞显微注射、荧光免疫、电泳技术、杂交瘤技术、DNA转染核细胞转化、分子杂交等,12,实验操作者需要注意的问题,掌握操作技术，理解各种操作的基本原理 有判定细胞生长好坏和是否发生污染的能力 熟悉体外培养细胞的生存条件、细胞的生物学性状和相关的基本理论知识。,13,各种液体要专人配制，并保证做到按规程行事；制备浓度精确、灭菌可靠。所有制备好的溶液和试剂瓶上都要有标签，注上名称、浓度、消毒与否和制备日期。 一切培养用品都要有固定的存放地点（尤其培养用品与非培养用品应严格分开；以消毒与未消毒品应严格分开存放）， 目的：避免各种杂质混入细胞生存环境、防止微生物感染和细胞“污染”。 细胞污染：不同细胞之间因操作不严造成的相互混杂，使细胞群体部村的现象。,组织培养是一种程序比较复杂、需求条件多而严格的实验性工作。由于工作环节多，为保证操作上的一致性，避免造成人为的差异，应将所有操作程序制定统一规范，在一定时间内保持相对稳定和人人遵守。,实验室管理制度,14,三、组织培养优缺点,优点： 能长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动 ；可用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科的研究工作 便于观察、记录、摄影 ，直接观察细胞变化 可供研究的细胞种类广泛，从低等生物到高等动物，以及人类；从胚胎到成体；从正常组织到肿瘤细胞，皆可 便于使用不同方法研究细胞（相差显微镜、荧光显微镜、电自显微镜、组织化学和同位素标记等）,15,易于施加物理、化学和生物因素进行实验 培养细胞携带有与体内细胞同等的基因组，也是分子生物学和基因工程学的研究对象和组成部分。 可同时提供大量生物性状相似的实验对象，耗资少，经济。 已成为生物制品、基因工程制品、单克隆抗体生产的必要手段,16,作为一种技术，有其局限性 组织和细胞离体以后，独立生存在人工培养环境中，与体内环境相比，仍有很大差异。故实验结果不能外推至体内，轻易做出与体内等同的结论。,17,组织培养基本理论知识,组织培养技术 第一章,18,一、组织培养细胞生物学,19,体内外细胞的差异 当细胞被置于体外培养后，一旦失去神经体液的调节和细胞相互间的影响，生活在缺乏动态平衡的环境中，发生变化是必然的。 培养细胞最多见的表现是：失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不显、出现类似“返祖现象”；表现为细胞趋向单一化，或获得不死性，或变成具有恶性性状的细胞群。,20,可能的机制：组成人体的细胞高度分化，细胞间呈现着高度的相互依存性、个体细胞相对失去独立性。从受精卵形成开始，细胞的两个基本过程增殖和分化，便协调地进行着。增殖使细胞数量增多，分化使机体结构和功能多样化，最终演变形成完整的人体。此间每个细胞的生命活动，均听命于外源信号，通过相关基因的调控，使之发生增殖或分化的表达。当细胞被立体培养后，信号来源切断，特定基因分化表达减弱或停止。而进化中保守的细胞增殖活动却可维持；遂使体内外细胞出现了差异。,21,培养细胞的分化 不适应 deadaption 细胞在体内的分化特性减弱或不表现，如干细胞产生酪氨酸转移酶的特性的丧失。 主要因环境改变所致。细胞在体外培养时间越长，分化改变越大；细胞刚立体培养时，先出现的现象可能属不适应，即由于环境的改变而出现的变化。 生存条件的改变是分化发生阻抑；,22,去分化dedifferentiation 细胞失掉发生分化的能力。如肝脏细胞，当肝细胞失掉产生精氨酸酶、氨基转移酶等特性后，则失掉储存肝糖原能力，并很难再现。 从分子水平考虑，去分化可能是基因变异所致。 体外培养细胞不仅有分化潜能，是脊髓细胞来源中枢和遗传性状的不同，很多细胞也呈现一定程度的分化表达现象。如毛细血管内皮细胞在体外培养时，可形成类似血管样结构，但仅限于初代培养和接种在类似基膜物质底物上生长时才可发生。说明与体内条件越近四是，细胞越易发生分化。细胞离体培养时间越长，分化能力越差；培养细胞在体外生存时间与其分化能力成反向关系。,23,细胞置于体外培养时，因环境的改变，细胞分化的表达形式也发生了与体内时不同的变化。如二倍体成纤维细胞，在体外可传30-50待，相当于150-300个细胞周期，最后衰老死亡，呈现着生命发展分化过程。 阐明细胞分化机制不仅是了解癌变机理和攻克癌症的核心问题，也是人们支配生物生长、解决人类物质需要的极重要的手段，培养细胞是研究分化最理想的实验对象。,24,有分化特性的细胞系和细胞株,25,培养细胞形态分类 贴附型 能贴附在支持物表面生长。大多数培养细胞呈贴附性生长；只依赖于贴附才能生长。 贴附后，易失去其原有的特征，细胞分化现象常不显著。在形态上表现单一化的现象，并常反应其胚层起源，呈现类似“返祖现象” 成纤维细胞、上皮型细胞、游走型细胞及多形型细胞,26,（1）成纤维性细胞： 细胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质向外伸出2-3个长短不同的突起。 细胞生长时多呈放射状、火焰状或漩涡状走行。 包括成纤维细胞，中胚层间充质起源组织（心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等）,细胞培养类型,27,（2）上皮型细胞 扁平不规则多角形，中有圆形核，细胞紧密相连成单层膜。 起源于内、外胚层细胞（皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝、胰和肺泡上皮）,28,（3）游走型细胞 在支持物上散在生长，一般不连接成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快而且不规则。 此型细胞不稳定,29,（4）多形型细胞 上述三型细胞，神经组织细胞等,30,悬浮型 胞体为圆形 悬浮在培养液中生长，生存空间大，容许长时间生长，能繁殖多量细胞，便于做细胞代谢等研究。,31,培养细胞的形态结构 大体形态： 液体环境中，胞体呈圆形；当贴附于支持物表面后，开始为圆形，很快过渡成扁平形态。细胞大体形态可随支持物的构型而改变。 普通光镜下，细胞是均质而透明的，结构不明显。 相差显微镜可看清细胞的轮廓和内部结构。固定染色法和特殊技术可显示细胞器等结构。,一代生存期：潜伏期、指数增生期和停滞期,32,超微结构： 电镜下可见细胞膜、细胞器等。 细胞外衣：细胞膜表面常附有由细胞分泌物形成的糖蛋白膜，对细胞的运动和贴附有作用。用胰蛋白酶消化处理细胞，能改变其性质，使细胞易从支持物上脱落下来。,33,培养细胞生长与增殖过程 传代 passage / subculture： 当细胞增值达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存。 （一）组织培养细胞生命期 （二）组织培养细胞一代生存期,34,（一）组织培养细胞生命期,初代培养期primary culture 从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1-4周。 此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。形态相似。 细胞群是异质的，也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。 传代培养期 初代培养期一经传代后便改称做细胞系cell line。此期为三期最长者。可维持二倍体核型（二倍体细胞系）。 当传代30-50代后，细胞增殖逐渐缓慢，以致完全停止。,Life span of culture cells,35,衰退期 细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡 少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代末或衰退期），细胞可能发生自发转化 转化标志： 细胞获得永生性（细胞或持久性增殖能力），核型多变成异倍体,36,37,（二）组织培养 细胞一代 生存期,细胞一代 从细胞接种到分离再培养时的一段时间。 为培养工作中的习惯说法,38,39,体外培养细胞一代增殖生长过程,潜伏期： 悬浮状态，胞体呈圆球形。接着是贴附在底物表面上，称为贴壁，贴壁后变成极性细胞。 0-24小时 指数增生期： 增殖旺盛，是进行各种实验最好的和最主要的阶段。 接触抑制 密度抑制：培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，发生密度抑制，导致细胞分裂停止。 停滞期 细胞数量持平，无增值活动，但有代谢活动。此时需传代,40,培养细胞增殖动力学 人体细胞有两种基本状态：增殖态、功能态,细胞存在形式和细胞增殖周期关系,41,有丝分裂 G1期： 细胞分裂后期，蛋白质合成、RNA合成，胞体逐渐增大。有调节点 S期： DNA合成期，此阶段，易受致突变或致癌因素作用；遗传物质易受致突变物损伤的时期。 G2期： 细胞分裂前期，对外界环境敏感，易受影响受阻不能进入M期。 M期： 细胞有丝分裂期，分四期,（一）增殖态,Proliferation state,42,细胞进行特定功能活动如分泌、传导、吞噬、收缩等的时期，是细胞的第二种生存状态。 是两次增殖周期间的间期，或称G0期。,体外培养细胞属活跃增殖细胞，在培养液中营养充分条件下，可反复进行增殖活动，具有较短的G0i期。 正常细胞增殖，须提供生长因子；恶性转化细胞可自泌产生生长因子，降低了血清需求。,（二）功能态,Functional state,43,培养细胞遗传学特征 核型变化： 初代培养时为二倍体细胞，传代后可能长期保持二倍体状态为主，经过长期传代后，会偏离二倍体呈多倍体和异倍体 长期不用的细胞或新引入的细胞应做定期核型检查 永生化及恶变 体外培养的正常细胞的两个主要特征：二倍体核型，增殖生长期有限 细胞永生化也称不死性，而恶性细胞不仅能长期增殖生长并有异体接种致瘤性 细胞型别 女性的一条X染色体在间期呈明显的异固缩状态，呈三角形或半月状小体紧附在核膜内面，称巴氏小体；男性Y染色体在间期则形成颗粒状Y小体，位于胞核的近中央部位。用特殊染色法可显现出巴氏体和Y小体。,44,细胞间、细胞与基质间的关系 在体外培养系统中，在一定条件下，单个细胞也能生和增殖生长，表现有很大的独立性。 一个有活力的细胞中须经过繁殖形成群体，只有群体细胞才是培养细胞的基本存在形式。 在生理活动上，群体细胞生存力强，细胞量多时比少时易于培养，说明细胞之间能相互沟通信息。,45,二、细胞生存条件及代谢,46,无污染环境 培养环境无毒和无菌是保证培养细胞生存的首要条件。 细胞被置于体外培养后，失去了对微生物和有毒物质的防御能力，一旦被污染或自身代谢物积累等，可导致细胞死亡。,（一）基本条件,47,适宜温度 人体细胞的适宜温度为36.5+0.5，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。 培养细胞对低温的耐受力比对高温强。 温度不低于0时，对细胞代谢虽有影响，但并无伤害作用； 对培养液中加一定量的保护剂（甘油或二甲基亚砜），封入安瓿中，冻存于液氮中，能长期储存，解冻后细胞复苏，仍能继续增殖生长，细胞生物性状不受任何影响，成为保存细胞最主要的手段。,温度对细胞生长的影响,48,气体和pH值 O2参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。多数细胞缺氧不能生存。 开放培养时（碟皿或培养瓶松盖培养），一般要把细胞置于95%的空气加5%CO2混合气体环境中。CO2既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，主要作用在于能维持培养基的pH值。大多数细胞要求7.2-7.4。,CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3-,49,CO2影响培养基的作用在于： 为维持培养液的恒定pH值，最常用为加磷酸缓冲液的方法。其中的NaHCO3能供给CO2，但CO2易于逸出，故只适用于封闭式培养。常用Hanks平衡盐溶液中含有低浓度的NaHCO3，当打开含有Hanks液培养瓶时，则CO2迅速逸出而导致酚红指示剂变红，表明培养液变碱。细胞在碱性环境中时间过长可使细胞碱中毒；因此开放式培养时，需放在含有5%CO2的气体环境中培养。也可用羟乙基哌嗪乙硫磺酸HEPES，它对细胞无毒性，也不起缓冲作用，主要防止pH值的迅速变动，其最大的优点是在开瓶通气培养或活细胞观察时能维持较恒定的pH值。,50,营养物质 糖、无机盐 氨基酸、维生素 促细胞生长因子 血清是提供生长因子和细胞所需物质的来源 渗透压 离子强度：260-320 mOsm/Kg 人工培养基,51,人工培养基 按物质形态分为：液体及半固体培养基（软琼脂-） 按来源分： 合成培养基 synthetic medium 根据已知细胞所需物质的种类和数量严格配置而成的。 天然培养基 natural medium 仍需加入一些天然成分如人或动物的血清、血浆和胎汁等，否则细胞仍不能很好生长繁殖，当前主要使用血清，其中以牛血清为主。血清中有多种促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质等。 细胞培养在合成培养基中，不能很好生长增殖；当加入5%血清时，大多数细胞能维持细胞不死和缓慢生长。一般需加10-20%的血清，细胞才能顺利增殖生长。 但是添加血清后不明成分增多，对分析实验结果增加了困难。 无血清培养基,52,附着物 玻璃 透明、便于观察、易洗涤和能反复使用等优点，中性玻璃最好，适合各种细胞附着生长。缺点为易碎。 聚苯乙烯 疏水性，光洁平坦，用于培养正常细胞、无限细胞系、转化细胞和肿瘤细胞生长均可。 微载体 聚苯乙烯和聚丙烯酰胺制成的小球体,凡对细胞无毒性的物质都可用作底物，不同细胞对底物要求各异。,53,（二）体外培养成功率分析,关键在初代培养 “培养成功”的定义： 不论用细胞消化分散法或组织块培养法进行培养时，培养物必须能贴附在底物上，继而细胞才能发生运动、生长增殖、细胞数量增多 扩大再培养,54,供体条件 培养条件 不同细胞选用相应的培养基 贴附底物 贴附使细胞增殖生长的条件。尤其对初代培养更重要 培养方法 选择适宜的消化法和培养法,55,三、细胞系或细胞株的建立,各种已被命名和经过细胞生物学鉴定的细胞系或细胞株，都是一些形态比较均一、生长增殖比较稳定的和生物性状清楚的细胞群。,56,初代培养细胞（原代） 直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。 传代细胞系： 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。 如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称无限细胞系（多发生异倍化，具异倍体核型，永生性，有些仍保留接触抑制和无异体接种致瘤性）,（一）培养细胞的种类及命名,57,克隆细胞株 从一个经过生物学鉴定地细胞系用单细胞分离培养获通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。再由原细胞株进一步分离培养出与原细胞株性状不同的细胞群，称亚株 subunit 二倍体细胞 细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同的细胞群。属有限细胞系，寿命长短各异，人胚肺成纤维细胞可传50+10代，人胚肾只有8-10代。 为保持二倍体细胞能长期被利用，一般在初代或2-5代即大量冻存作为原种，用时再进行繁殖，用后再继续冻存，可供长期使用和延缓细胞的衰老。,58,遗传缺陷细胞 从先天缺陷者取材培养的细胞 先天或人工诱变（2n或异倍） 肿瘤细胞系（株） 现有细胞系中最多的一类，多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常已传几十代或百代以上，并具有不死性；和异体接种致瘤性。 举例： HeLa 供体患者姓名 CHO 中国地鼠卵巢细胞 NIH3T3 美国国立卫生院建立 宫-743： 宫颈癌上皮细胞,59,记录要求： 组织来源、细胞生物学检测、培养条件和方法 鉴定、管理和使用 按国际惯例，在杂志或刊物上报道，详细介绍上述各项目即可。 各国管理中心、细胞库 美国标准细胞库ATCC、人遗传突变细胞库HGMR、细胞衰老细胞库CAR,（二）细胞株建立要求及管理,60,ATCC入库细胞要求检测项目（基本要求）： 培养简历：组织来源日期、物种、供体情况、细胞传代情况等 冻存液：培养基和防冻液名称 细胞活力：融解前后细胞接种存活率和生长特性 培养液：培养基种类和名称、血清来源和含量 细胞形态：类型 核型：二倍体或多倍体，标记染色体的有无 无误染测验：包括细菌、真菌、支原体、原虫和病毒等 物种鉴定：检测同工酶，主要为G6PD和LDH，以证明细胞有否交叉污染 免疫检测：一两种血清学检测 细胞建立者：建立者姓名；检测者姓名,61,组织培养技术的应用,组织培养技术 第二章,62,一、病毒学研究的应用,检测病毒 病毒的增殖，分离病原体的重要手段，还为研究病毒的亲细胞性和亲组织性提供了非常方便的方法。 增殖指标：CPE、Ph变化、包涵体等 病毒定量：PFU、TCID50 病毒和细胞间关系 致病机理,病毒性感染的血清学诊断,肿瘤病毒致癌机理的研究（转化）,63,病 毒 检验方 法,病毒培养 全程5-30天,病毒培养： 1.细胞培养 2.接种至细胞,64,用培养方法研究病毒学的优点： 没有隐性感染，避免体内实验的假阳性或假阴性结果。 没有免疫抵抗力 可选出培养方法可以选择出最易感的细胞进行研究 可增加接种量 获取减毒株或无毒株较其他方法容易 大规模植被病毒疫苗，可提高产量，降低成本，还可以是培养液中的异性蛋白减低至最低限度,提高疫苗质量。 可快速分离鉴定病毒,65,66,二、免疫学研究的应用,免疫细胞检测 T、B淋巴细胞分离培养技术 淋巴细胞转化试验 混合淋巴细胞培养 抗体产生细胞检测,67,杂交瘤细胞培养技术,目前，已能够利用大规模培养技术培养杂交瘤细胞生产抗体、不仅可以提高产量、简化工艺、降低成本，而且可以提高抗体质量。,68,Hybridomas,杂交瘤技术,69,单克隆抗体制备流程： 用特异抗原免疫实验动物 取含大量B细胞的脾细胞 鼠骨髓瘤细胞 细胞融合 筛选杂交瘤细胞 生产单克隆抗体,70,杂交瘤细胞产生 单克隆抗体示意图,71,细胞因子检测技术 免疫酶技术,72,三、分子生物学研究的应用,1. 体外培养细胞的转化 细胞自发转化和人工诱发转化 BHK-21, NIH/3T3, Rat-1, PC-12,73,2. DNA转导技术,74,3. 基因诊断和基因治疗 原位修复有缺陷的基因 基因替代疗法 重新开放已关闭的基因 导入基因（p53 ,RB） 封闭基因 （反义RNA）,75,四、遗传学研究的应用,性染色体的检测 间期细胞核内女性X染色体和男性Y染色体均可用特殊染色法显示出来，女性的两个X染色体中的一个，在间其时的染色质呈异固缩，呈深染的小体称巴氏小体，位于间期细胞核内面，呈三角形或半月形小体易为炭酸复红或硫堇等染料着色。正常女性巴氏体阳性,男性为阴性。男性Y染色质位于间期细胞核近中央部，荧光染色发较强荧光，呈点状小体，发光部分为Y染色体异固缩的长臂。 初代培养细胞和二倍体细胞株均可观察到性染色质，传代细胞系表现不规律。,76,培养细胞染色体显示 显示染色体主要是显示分裂中期细胞。因细胞分裂出于中期时，染色体的长短和大小适合，是研究染色体的最好阶段。 准备工作的原则： 获得多量的中期分裂相 分散密集并相互缠绕的46条染色体,77,措施： 提高细胞分裂相数 刺激细胞增殖：PHA 阻抑中期分裂：秋水仙素 促染色体分散措施 低渗处理：低渗盐溶液 醋酸固定：膨胀固定组织细胞，和醇类混合固定有利于染色体松散效应。,78,染色体结构显带和检测 染色体显带、染色体脆性部位的检测、微核检测 染色体基因定位 核素标记原位杂交基因定位技术 荧光标记原位杂交基因定位技术 染色体显微切割法,79,五、 药理学研究的应用,体外细胞培养测定药效研究的优点： 已建的细胞系（株）提供大量的遗传特性均一或相似的细胞来源，使药物筛选研究工作稳定、方便、经济。 可准确控制药物作用的对象、作用时间和剂量以及细胞的生长条件。 将待检测药物或其他化合物直接加到培养系统中，使之直接与效应细