实验二蛋白质含量的测定凯氏定氮法.ppt

实验二 蛋白质含量的测定凯氏定氮法,一 目的： 学习凯氏定氮法测定蛋白质含量的实验原理 掌握蒸馏、滴定操作技术,三聚氰胺C3N6H6,“蛋白精”,二、原理：蛋白质含N量约为16，测出含氮量推知蛋白含量。,消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮- -硫酸铵。添加硫酸铜和硫酸钾的混合物，前者为催化剂，后者提高硫酸沸点。 CH2NH2COOH+3H2SO4 2CO2+3SO2十4H2O十NH3 2NH3+H2SO4 (NH4)2SO4 蒸馏吸收：浓碱使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到硼酸溶液中，硼酸吸氨后使溶液中的氢离子浓度降低，指示剂变色 (NH4)2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2H2O + 2NH3 NH3 + HBO2 NH4BO2 （H3BO3 HBO2 + H2O） 滴定：标准HCl滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止，根据所用标准酸的摩尔数(相当于待测物中氨的摩尔数)，计算出样品中的总氮量。 NH4BO2 + HCl HBO2+NH4Cl,消化,蒸馏、吸收,滴定,三、试剂与器材,1、消化液：H2O2：H2S04 ：H2O=3：2：1 2、粉末硫酸钾硫酸铜混合物 K2S04与CuS04.5H20以 3：1混合 3、30氢氧化钠溶液 4、2硼酸溶液 5、标准盐酸溶液(约0.01 molL) 6、混合指示剂(田氏指示剂) 由50mL 0.1甲烯蓝乙醇溶液与200mL 0.1甲基红乙醇溶液混合配成，棕色瓶贮存。 酸性时为紫红色，碱性时为绿色。变色范围很窄且灵敏。 7、待测样品,1.凯氏烧瓶 2.凯氏定氮仪 3.分析天平 4.酸式滴定管 5.烘箱 6.消化炉 7.容量瓶 等等,四、操作方法,1. 消化前样品处理 固体样品: 某一固体样品中的含氮量是用100g该物质(干重)中所含氮的g数来表示()。 固体样品105烘干至恒重。 用坩埚钳将称量瓶放人干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。每干燥1小时后，称重一次，直到两次称量数值不变，即达恒重。 若样品为液体(如血清等)，可取一定体积样品直接消化测定。,2、消化,取凯氏烧瓶 标号。各加几颗玻璃珠; 1及2号瓶中各加样品0.1g，催化剂200 mg，消化液5 mL。3及4号瓶中各加相同量的催化剂和消化液-对照，以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。 消化开始时应控制火力，不使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力消化，直至消化液呈透明淡绿色。 定容：冷却后，加蒸馏水(慢加，随加随摇)。将瓶中液体倾入50 mL或100 mL容量瓶，并以蒸馏水洗烧瓶数次，洗液并入容量瓶，定容。,加样时应直接送人瓶底，不要沾在瓶口和瓶颈上。,3、蒸馏吸收： 改进型凯氏定氮仪,特点：将蒸汽发生器、蒸馏器和冷凝器组成一个整体，体积小，安装容易，操作简便。 1)水蒸汽发生器和反应室 2)冷凝器和通气室 3)排水柱 关键：搞清水管系统,蒸馏器的洗涤,.接通冷凝水，向蒸汽发生器中加入一定量的水(以排水口高度为宜)，酒精灯加热烧开。 .水的自动喷出： 将蒸馏水从加样室加入反应室 将酒精灯移开片刻，反应室内水自动喷出到蒸汽发生器 打开蒸汽发生器出水口，放水。 如此反复清洗3-5次。 .清洗后在冷凝管下端放一锥形瓶盛有5 mL，2硼酸溶液和12滴指示剂的混合液。如不变色则表明蒸馏装置内部已洗涤干净。,蒸馏吸收,准备: 取50 mL锥形瓶3个，各加入5 mL 硼酸溶液和1滴指示剂，溶液呈淡紫色，表面皿覆盖备用。 关闭冷凝水，打开自由夹，使蒸汽发生器与大气相通。将锥形瓶放在冷凝器下，冷凝器下端浸没在液体内。 加样: 移液管取3 mL消化液（空白液和样品消化液分别做），加入反应室，用小量筒加NaOH溶液5mL，关闭自由夹，少量水封口。 蒸馏: 关闭自由夹，打开冷凝水。 点燃酒精灯，蒸馏开始，锥形瓶中溶液由淡紫色变绿时(约2-3分钟)开始计时，蒸馏3分钟，移开锥形瓶，使冷凝器下端离开液面约1cm，继续蒸馏1分钟，取下锥形瓶，表面皿覆盖。 蒸馏完毕后，应立即清洗反应室，方法如前所述。 重复3次。最后将自由夹同时打开，将蒸汽发生器内的全部废水换掉，继续下一次蒸馏。,4、滴定,全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，硼酸指示剂溶液由绿变淡紫色为滴定终点。 注意：使用前检查酸式滴定管漏不漏？漏的话，涂凡士林 滴定时一边滴一边摇，防止滴定过头！ 及时记录读数 要求：空白液1次，样品消化液2次,5、计算,总氮量 () = c为标准盐酸溶液摩尔浓度(0.0098M)； V1为滴定样品消化液用去的盐酸溶液平均mL数； V2为滴定空白液用去的盐酸溶液mL数； w为样品重量(1g)。 14为氮的相对量子质量。 消化液总量500ml, 蒸馏时消化液用量3ml,样品蛋白质含量()=总氮量6.25,注意事项,冷凝水的开、关 自由夹：中间 酒精灯：加到2/3，防止燃烧中途不够 蒸汽发生器中：水到瓶颈凹陷处 火焰 小心照看，防止反应液喷出 防止烧到橡胶管 冷凝管末端不用时防在干净的烧杯中，防止NaOH污染 空白：蒸10分钟未变色，再蒸3分钟 铁架台：夹子口朝上,