《微生物的诱变育种》PPT课件.ppt

第五节 微生物的诱变育种,一、诱变育种中的几个原则,指利用物理或化学诱变剂处理微生物群体细胞，促进其突变率显著提高，然后设法从中选取少数符合育种目的的突变株。,2个主要环节：,诱变（随机）,选用合适的诱变剂和诱变剂量处理大量均匀、分散的微生物细胞，以引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中的突变频率大大提高。,筛选（定向）,设计有效的筛选方法，将少量正变株中的优良菌株挑选出来。,（一） 出发菌株（original strain）,出发菌株指用于诱变育种的起始菌株。,具有有利性状（如高产、生长速度快、营养要求粗放、 标记明显等）； 对诱变剂敏感,野生型菌株； 从生产中选育的自发突变菌株； 诱变获得的高产菌株,出发菌株的选择标准：,出发菌株的来源：,（二） 菌悬液的制备,1. 选用单细胞或单孢子悬液（均匀、分散）,目的：使每个细胞能均匀接触诱变剂； 减少表型延迟现象（诱变后性状的分离及退化现象）,2. 同步培养（生理状态一致）,3. 菌龄：对诱变剂最敏感时期 营养细胞：对数期 孢子或芽孢：萌发前期,4.菌悬液的制备方法 物理诱变：生理盐水配制 化学诱变：缓冲液配制,5. 菌悬液的浓度 酵母菌，霉菌的孢子：106个/mL 细菌，放线菌孢子：108个/mL,（三）诱变剂的选择及处理方法,1. 诱变剂的选择（高效，简便）,物理诱变剂：频度低、大损伤，难修复，且操作简便； 化学诱变剂：频度高，点突变，易回复突变，操作麻烦。 ( NTG超诱变剂）,UV是最常用的一种诱变剂,2. 剂量的选择,突变率随剂量的增加而提高，但到达一定程度后，再提高剂量, 反而会使突变率下降。 正变较多出现在偏低剂量中，而负变较多出现在偏高剂量中。,在产量变异工作中，常采用相对杀菌率为7075%, 甚至3070%的剂量。,UV的剂量: 固定UV功率和照射距离,以照射时间长短来确定剂量多少。,最适剂量：在提高突变率的基础上，既能扩大变异幅度， 又能使变异向正突变范围移动的剂量。,常以杀菌率来表示相对剂量（剂量-存活率曲线）,3. 诱变处理方法,单因素处理或多因素的复合处理： 同一诱变剂的重复使用； 两种或多种诱变剂的先后使用； 两种或多种诱变剂的同时使用.,（四） 中间培养（CM，培养过夜）,目的：克服表型延迟,表型延迟（phenotypic lag）：表型的改变落后于基因型改变的 现象. 分离性延迟： 突变的基因经DNA复制和细胞分裂后变成纯 合状态，表型才能表现出来。 生理性延迟： 由杂合状态变为纯合状态，突变表型仍不能 表现出来。,分离性延迟的原因: 对数生长期中，单核细胞常出现双核现象，多核细胞的核也成倍增加，诱变对数期的细胞时，突变通常发生在一个核上，故其变异或非变异的细胞必须经过一代或几代繁殖才能分离，这种纯种变异细胞出现的推迟现象称为分离延迟现象。,生理性延迟的原因: 当变异细胞由杂合状态变为纯合状态时,由于杂合期所合成的非变异的蛋白或酶仍然发挥作用,必须经过细胞多代分离后,才能将这些非变异的酶稀释掉,最终达到变异后应该表现的形态,如营养缺陷型突变株的筛选过程。,生理性延迟:,（五）突变株的筛选,初筛 复筛,1. 初筛（以量为主）,（1）利用形态变异：需预先测定形态与产量的相关性,（2）根据平板颜色反应直接挑选 透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）； 抑菌圈法（抗生素）； 变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）； 沉淀圈法（外毒素） 透明圈直径（H）/菌落直径（C）：产量高低（初筛指标）,2. 复筛（以质为主，定量测定）,摇瓶培养，直接检测所需产物,方法需简便、快速,2步,诱变育种的基本原则：,选择简便有效的诱变剂； 挑选优良的出发菌株； 处理单细胞或单孢子悬液； 选用最适的诱变剂量； 充分利用复合处理的协同效应； 利用和创造形态、生理与产量间的相关指标； 设计高效筛选方案； 创造新型筛选方法。,二、几种重要突变株的筛选方法,1. 抗性突变株的筛选 (1) 抗终代谢物结构类似物突变株的筛选 (2) 抗药性突变株筛选 2. 营养缺陷型的筛选,1. 抗性突变株的筛选 （1）抗终代谢物结构类似物的突变株 用途：筛选相应代谢物的高产菌株 （2）抗药性突变株 用途：筛选相应药物(抗生素) 的高产菌株或遗传标记制作 筛选的方法: a. 高于临界浓度的平板进行分离； b. 梯度平板法,敏感菌苔,抗性菌落,加入含异烟肼的上层,加入不含异烟肼的底层,所谓结构类似物（又称代谢拮抗物）是指那些在结构上和代谢终产物（氨基酸、嘌呤、维生素等）相似的物质。 如：异烟肼（“雷米封”）是吡哆醇的结构类似物，利用含异烟肼梯度平板筛选异烟肼抗性突变株，可达到定向培育吡哆醇高产突变株的目的。 为什么在筛选突变株时,不能直接用代谢产物,而必须用其结构类似物?,2. 营养缺陷型突变株的筛选,（1）几个概念：,三类培养基：,基本培养基（MM, minimal medium）-：,某野生型能生长的最低成分的组合培养基。,完全培养基（CM,complete medium）+：,各种营养缺陷型能生长的天然或半组合培养基,补充培养基（SM, supplemental medium）A:-+A B:-+B,相应营养缺陷型能生长的组合或半组合培养基,三种遗传型：,野生型（wild type）,从自然界分离到的、发生营养缺陷型突变前的原始菌株。 A+B+, 可在-生长。,营养缺陷型（auxotroph）,野生型菌株经诱变剂处理后，由于发生了丧失某种酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变菌株（主要指合成维生素、氨基酸及嘌呤、嘧啶的能力）。 A+B-：能在+、B生长 A-B+：能在+、A生长 A-B-：能在+生长,原养型（prototroph）,营养缺陷型经回复突变或重组，回到原来野生型的营养要求 A+B+, 可在-生长,（2）筛选步骤（5步）,诱变处理,中间培养,淘汰野生型,检出缺陷型,鉴定缺陷型,中间培养,CM或SM培养基，培养过夜。克服表型延迟。,淘汰野生型,即浓缩缺陷型，以提高检出率,方法 抗生素法（G+细菌：青霉素；酵母菌和霉菌：制霉菌素） 菌丝过滤法（丝状真菌、放线菌）,饥饿培养（无N）MM 612 h 2N培养(2N)MM 12 h 加抗生素(或菌丝过滤)，培养过夜, 营养缺陷型的检出,方法,逐个检出法 夹层培养法 限量补充培养法 影印平板法, 营养缺陷型的鉴定,生长谱法：,快速，直观,分两步：,a.三大类营养要求（氨基酸、维生素、核苷酸）的鉴定 b.具体到某一种营养要求的鉴定(哪一种氨基酸,哪一种 维生素,或哪一种碱基),具体操作:一般采用“滤纸片法”,a. 不含维生素的酪素水解液或氨基酸混合液 b. 维生素混合液 c. 0.1%碱水解酵母核酸液,a,b,c,三大类营养要求的鉴定：,以氨基酸缺陷为例进行说明 将18种氨基酸按右表分为6组 特点：每2组只有一种共同物质,单一营养物质要求的鉴定：,1,3,5,2,4,6,（3）营养缺陷型的用途 生产菌 (氨基酸、核苷酸、维生素等高产菌需求)； 研究代谢途径和杂交、转化等遗传规律的遗传标记。,诱变育种的程序：实验讲义p175 出发菌株（纯化） 前培养（ CM ，培养至对数期） 菌悬液制备 活菌计数 诱变预备实验（剂量存活率曲线） 诱变处理（相对杀菌率为70-75%，30-70%） 活菌计