蔗糖酶理论讲授-2.ppt

1,三、实验步骤及原理,1、蔗糖酶的提取 2、蔗糖酶的纯化 3、各纯化级别蔗糖酶的活性测定 4、各纯化级别蔗糖酶的蛋白质含量测定 5、正交试验法测定不同条件对蔗糖酶活性的影响 6、蔗糖酶酶促反应动力学研究 7、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量,2,1、蔗糖酶的提取 (细胞破壁) 自溶法破壁（本实验）,干酵母粉,溶于蒸馏水,乙酸钠,乙酸乙酯,35恒温,搅拌40分钟,35恒温过夜,补加蒸馏水,搅拌均匀，成糊状,离心,弃沉淀及脂层,E1,记录生产厂家和批号 用硫酸纸封严（过夜）,3,2、蔗糖酶的纯化,4,1. 酶的蛋白属性； 2. 调节酶溶解度的方法； 有机溶剂分级沉淀 3. 根据酶分子大小、形状不同的分离方法； 透析、凝胶层析 4. 根据酶分子电荷性质的分离方法； 离子交换层析 5. 根据酶分子专一性结合的方法;,酶的纯化方法,5,2. 调节酶溶解度的方法；,酶的纯化方法,（1）改变离子强度； 盐溶 / 盐析 硫酸铵分级沉淀（反抽提法） （2）改变pH或温度； （3）改变介电常数；,有机溶剂分级沉淀：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。 亲水性有机溶剂加入溶液后降低介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。 亲水性有机溶剂的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了表面水化膜的厚度，降低其亲水性，导致脱水凝集。,6,有机溶剂分级沉淀操作条件的控制 溶剂选择 常用的溶剂是乙醇、丙酮、甲醇，二甲基甲酰胺、二甲基亚砜也可做沉淀剂。沉淀用有机溶剂的选择主要应考虑沉淀作用强、对生物分子的变性作用小、毒性小以及挥发性适中。 温度 使用有机溶剂沉淀生物大分子时应控制在低温下进行。 样品浓度的控制 一般认为蛋白质的初始浓度为 0.5%-2% 为好。,7,3. 根据酶分子大小、形状不同的分离方法；,酶的纯化方法,（1）离心分离； （2）透析、超滤； （3）凝胶层析 （gel chromatography）,凝胶层析的定义： 凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析 凝胶层析 常见名称：凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析、凝胶渗透层析。,8,凝胶层析的基本原理,凝胶层析是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，其原理是分子筛效应，混合样品如同“过筛”一样，因分子大小的不同得以彼此分开。 在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部，而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外；而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，路径长、流速慢，以至最后流出柱外。,9,4. 根据酶分子电荷性质的分离方法；,酶的纯化方法,离子交换层析 基本原理 ： 以离子交换剂为固定相，以特定的离子溶液为流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。 在介质中带正电的物质用阳离子交换剂；带负电物质用阴离子交换剂,10,3、蔗糖酶的活性测定 酶活力 (enzyme activity) 酶催化某一反应的能力V,V单位时间内单位体积中 底物 (substrate) 的减少量或 产物 (product) 的增加量,11,国际单位（IU）：在特定的条件下，每分钟催化1mol 底物转化为产物所需的酶量。 催量单位（kat）：在特定条件下，每秒钟使1mol底物转 化为产物所需的酶量。,1 IU= 16.6710-9 kat,酶活力单位：,2、酶活力和比活力表示方式,12,活力 (或总活力)涉及在样品中酶的总单位，而比活力是酶纯度的量度，是每毫克酶的催化活力数 (U/mg蛋白)。在酶的纯化过程中它的比活力逐渐升高，当酶提纯时，其比活力值成为最大和恒定。,酶的比活力 (specific activity，也称比活性）,比活力：指每mg蛋白质所具有的酶活力，一般用U/mg蛋白质来表示。 比活力= 酶活力（U/ml）/蛋白质浓度（mg/ml） 比活力有时也可用每g或每ml 酶含多少个活力单位来表示,13,DNS 法测定蔗糖酶活力（本实验）,1、 3,5-二硝基水杨酸比色定糖的原理：,2） 在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度成一定比例关系（可于比色测定），所以可用DNS比色法测定还原糖的含量。,1）,2、 蔗糖酶活力测定的原理： 1）蔗糖酶催化的反应是： 2）蔗糖酶活力的规定：在本实验条件下，每3分钟释放1毫克还原糖所需的酶量定义为一个活力单位。(附1) 3）该方法是半微量定糖法，操作简便、快速、杂质干扰较少。,蔗糖 D-果糖 + D-葡萄糖,蔗糖酶,14,3、 DNS比色定糖法工作曲线的制作： 取8支血糖管编号1-8，按下页表中的顺序和数量加入葡萄糖标准溶液（2mg/ml）、蒸馏水、3,5-二硝基水杨酸试剂，混匀后同时放入沸水浴中准确反应5分钟（注意：一定等沸水浴锅中的水沸腾后再放入试管，且不要用大烧杯代替沸水浴锅），取出后立即用流动的冷水冷却，加蒸馏水定容至25ml，摇匀，测定540nm处的吸光度值。 以葡萄糖(mg)含量为横坐标、A540值为纵坐标，画出工作曲线。,15,蔗糖酶活力的测定： 操作： 取两支试管分别加入用 pH4.6, 0.2mol/L 的醋酸缓冲液适当稀释过的酶液 2ml，一支中加入 0.5ml 1mol/L的 NaOH，摇匀，使酶失活（做对照），另一支做测定管；把两支试管和 5% 的蔗糖溶液放入 35 水浴中预热恒温；分别取 2ml 5% 的蔗糖加入上述两试管中，并准确计算时间，3 分钟后于测定管中加入 0.5ml 1mol/L 的 NaOH，摇匀，终止反应。 从反应混合物中取出0.5ml溶液放入血糖管中，加入3ml 3,5 二硝基水扬酸试剂和1.5ml水，摇匀。于沸水浴中准确反应5min，立即用冷水冷却，加水稀释至25ml，摇匀，于540nm处测光密度。 在葡萄糖标准曲线上找到所测定光密度值对应的葡萄糖含量，按下面公式计算酶活力： E = (葡萄糖mg数(4.5/0.5)E的稀释倍数/2ml)/2,16,紫 外 吸 收 法,双 缩 脲 法,Folin-酚法 (Lowry法),4、蔗糖酶的蛋白浓度测定,17,这是测定蛋白质含量最灵敏的经典方法之一，由于方法简便，灵敏度高，常为实验室所采用，也是文献上用得最多的方法之一。,Folin-酚法 (Lowry法),(A) 凡含有两个及两个以上肽键 (-CO-NH-) 的化合物在碱性溶液中 (如 Folin-甲试剂) 都能与 Cu2+ 作用，形成紫色的复合物； (B) 所有的蛋白质均可与 Folin-甲试剂反应形成紫色的铜-蛋白质复合物； (C) 铜-蛋白质复合物在 pH=10 的碱性溶液中可将磷钼酸-磷钨酸 (Folin-乙 试剂) 还原成兰色的钼蓝和钨蓝混合物，其颜色的深浅 (在一定范围内) 与蛋白质的含量成正比。,干扰物质与双缩脲法相同，而且受它们的影响更大。 （附2）,原理:,18,三种蛋白质测定方法比较,19,正交试验设计 (Orthogonal experimental design) 是研究多因素多水平的一种设计方法，它是从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点，正交试验设计是分式析因设计的主要方法。 是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。日本著名的统计学家田口玄一将正交试验选择的水平组合列成表格，称为正交表。,5、正交试验法测定不同条件对蔗糖酶活性的影响,20,6、蔗糖酶酶促反应动力学研究 酶促反应动力学是研究酶促反应的速度以及影响此速度的各种因素的科学，是酶工程研究中的一个重要内容。,21,1、影响酶促反应速度的因素 pH值 温度 酶浓度 底物浓度 激活剂 抑制剂,22,2、酶促反应动力学方程式米氏学说,S： 底物浓度 m： 米氏常数 Vmax：最大反应速度 V： 不同S时的反应速度,Michaelis L and Menten ML.,. Biochem Z. 1913, 49: 333369.,23,米氏常数（Km）的意义,Km值是酶的特征常数之一，只跟酶的性质有关，而与酶的浓度无关。 Km值作为常数只是对一定的底物、一定的pH、一定的温度条件而言，测定酶的Km值可以作为鉴别酶的一种手段。 1/ Km可以表示酶对底物亲和力的大小, 1/ Km越大, 表明亲和力越大, 多底物酶有不同的 Km值, 最适底物的Km值最小。,24,3、抑制剂对酶活性的影响,使酶的活性降低或丧失的现象，称为酶的抑制作用。 能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑制剂。 酶的抑制剂一般具备两个方面的特点： 在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。 能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体。,25,抑制剂的作用方式,不可逆抑制 抑制剂与酶反应中心的活性基团以共价形式结合，引起酶的永久性失活。 可逆抑制 抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。 根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为两类（竞争性抑制和非竞争性抑制),26,可逆抑制,(1) 竟争性抑制,某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。 竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。 加入竞争性抑制剂后，Km 变大，酶促反应Vmax不变。,27,酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与酶活性中心结合，所以称为非竞争性抑制剂。 如某些金属离子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能与酶分子的调控部位中的-SH基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。 加入非竞争性抑制剂后，Km 不变，但由于Vmax减小，所以酶促反应速度也下降了。,可逆抑制,(1) 非竟争性抑制,28,5、蔗糖酶米氏常数的测定（本实验） 1）将离子交换柱层析得的E3稀释(pH4.6 HAC缓冲液)至30U/mL，共16ml。 2）取试管8支，按07编号，0为对照管。 3）按P146页表将蔗糖液、醋酸缓冲液分别加入试管中，于35水浴中保温（使温度平衡，以下同）10min。 4）取16ml酶液，放入同一水浴中保温约10min。 5）于各管中依次按同样时间间隔加入已保温过的酶液2ml，记时，立即摇匀。在35水浴中准确反应3min。 6）按同样次序和时间间隔，加入0.5ml的1mol/L NaOH，摇匀，终止反应。 7）吸取反应混合物0.5ml，加入盛有3ml DNS试剂和1.5ml去离子水的血糖管中，放入沸水中加热5min，冷却后稀释定容至25ml，摇匀后，测定A540值,29,7、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,Sodium Dodecyl Sulfate, Polyacrylamid Gel Electrophoresis, SDS-PAGE,30,电泳：是指带电粒子在电场的作用下，发生定向 泳动的现象。 电泳技术：指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。,电泳？,31,蛋白质分子状态在自然状态下蛋白质通过二硫键聚合形成高度折叠的生物大分子，在水溶液中，由于氨基酸残基的解离作用使蛋白质分子形成带有一定净电荷的分子, 在电场下向自身电荷相反的方向移动。,32,3.按比例配好分离胶,用移液枪快速加入，距梳齿下缘约1cm，之后加少许蒸馏水，静置直到胶与水层间出现清晰界面。 加速剂TEMED要在注胶前加入，否则凝结无法注胶。 注胶过程最好一次性完成，避免产生气泡。 水封的目的是为了使分离胶胶面平整，并排除气泡。 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。 4. 倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶，连续平稳加 入浓缩胶至短玻璃板上缘0.5cm处，迅速插入样梳,静置直到胶凝好。 样梳需一次平稳插入，梳口处不得有气泡，梳底需水平。,实验过程,33,5. 在上槽内加入电极缓冲液，拔出样梳。 要使锯齿孔内的气泡全部排出，保证电流通畅。 6.用移液枪距槽底三分之一处加样。加样前,样品在沸水中加热3分钟，去掉亚稳态聚合。 进样要缓慢，不要使样品漂出泳道外面。 移液枪不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下沉时会发生扩散。 为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样。,实验过程,34,7. 电泳槽中加入缓冲