蛋白质的基本机构和功能-2.ppt

第二章 蛋白质的结构与功能,Chapter 2 Structure and Function of Protein,主 要 内 容,蛋白质的分子组成 蛋白质的分子结构 蛋白质的理化性质 蛋白质的分离纯化,蛋白质(Protein)的种类繁多,大肠杆菌约含蛋白质3 000种，人体内含蛋白质10万 余种。,蛋白质是细胞中含量最丰富的生物大分子,约占人体固体成分的45% ，可达细胞干重的70%。,蛋白质是生命的物质基础,1.催化功能 2.调节功能 3.支持功能 4.运输功能 5.营养功能,6.运动功能 7.防御功能 8.识别功能 9.信息传递功能 10.凝血与抗凝血功能,蛋白质的生物学功能,第一节 蛋白质的分子组成,C 5055% H 67% O 1924% N 1319% S 04% 有些蛋白质还含有P、Fe、Cu、Mn、Zn、Se等。 各种蛋白质含氮量接近，平均为16%；样品测定中1克氮相当于含6.25克蛋白质（凯氏定氮法） 。,一、蛋白质的元素组成,二、蛋白质的基本组成单位氨基酸,蛋白质受酸、碱或蛋白酶水解产生游离氨基酸。因此，组成蛋白质的基本单位是氨基酸(amino acid) 。,（一）氨基酸的分类,根据R侧链基团的结构和性质的不同，可将 20种氨基酸分为4类： 1.非极性疏水性氨基酸 2.极性中性氨基酸 3.酸性氨基酸 4.碱性氨基酸,1.非极性疏水氨基酸 侧链为烃基、吲哚环、甲硫基等疏水性基团。这类氨基酸在水中的溶解度小于极性中性氨基酸。,2.极性中性氨基酸 侧链为羟基、巯基、或酰氨基等极性基团，有亲水性，但在中性水溶液中不电离的氨基酸。,3.酸性氨基酸 侧链上有羧基，在水溶液中能释放出H+而带负电荷的氨基酸。有谷氨酸、天冬氨酸。,4.碱性氨基酸 侧链上有氨基、胍基或咪唑基，在水溶液中能结合H+而带正电荷的氨基酸。有赖氨酸、精氨酸和组氨酸等。,POLAR,NON- POLAR,Tyr,His,Gly,Acidic,Neutral,Basic,Asp,Glu,Gln,Cys,Asn,Ser,Thr,Lys,Arg,Ala,Val,Ile,Leu,Met,Phe,Trp,Pro,氨基酸按照极性分类,极性或非极性，是氨基酸性质的基础,-C-C-CONH2,-C-CONH2,-C-COOH,-C-C-COOH,-H,-CH3,-C-OH,-C-SH,-C-C-S-C,-C-C-C-C-NH3+,South line,Circular line,Central line,Northwest line,Aliphatic,Amide,Acidic,Imino, Circular,Basic,Sulfur,Hydroxy,Aromatic,氨基酸代谢图,(二)氨基酸的理化性质,1.物理性质 都是白色晶体，熔点较高。能溶于强酸和强碱溶液；在水中的溶解度各不相同。 2.两性解离与等电点 氨基酸是两性电解质，其解离方式取决于所处溶液的酸碱度。,氨基酸的等电点（isoelectric point,pI),在某一pH溶液中，氨基酸解离成阳离子和 阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电 中性，此时溶液的pH称为该蛋白质的等电点。,3.紫外吸收性质 色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸对紫外光有吸 收作用。其最大吸收峰在280nm附近，以色氨酸吸收最强。 利用此性质可采用紫外分分光度法测定溶液中蛋白质的含量。,4.氨基酸的化学反应 （1）茚三酮反应 氨基酸与水合茚三酮在溶液中共热，发生一系列反应，生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm。此反应可用于氨基酸的定性和定量分析。 注：脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮反应产生 黄色化合物。,氨基酸分析仪图解,（2）与亚硝酸反应:Van Slyke 法测定氨基酸 氨基酸的氨基在室温下与亚硝酸作用，生成氮气。通过在标准条件下测定生成的氮气体积，即可计算出氨基酸的量。 生成的氮气只有一半来自氨基酸。 可用于氨基酸定量和蛋白质水解程度的测定。,（3）桑格（Sanger) 反应 氨基酸的NH2与2，4一二硝基氟苯（DNFB）反应，生成DNP-氨基酸；黄色，提取、层析法鉴定来测定氨基酸。,（4）丹磺酰氯（DNS-Cl）反应 氨基酸的NH2与DNS反应；由于丹磺酰氯基具有强烈的荧光，灵敏度比DNFB法高100倍，并且水解后的DNS氨基酸不需要提取，可直接用纸电泳或薄层层析加以鉴定。,(5)埃德曼反应(Edman reaction） 苯异硫氰酸酯，PITC 苯乙内酰硫脲衍生物（PTH-氨基酸），无色，可以用层析法分离鉴定。 被Edman用来鉴定多肽的NH2末端氨基酸,三、氨基酸在蛋白质分子中的连接方式,（一）肽键和肽 肽键（peptide bond)是由一个氨基酸分 子的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合 形成的化学键。,命名、编号,第二节 蛋白质的分子结构,蛋白质是由许多氨基酸单位通过肽键连接形成的具有特定分子结构的高分子化合物。 蛋白质的分子结构可分为一级、二级、三级和四级。一级结构是蛋白质的基本结构，二级、三级、四级结构称为高级或空间构象。,一、蛋白质的一级结构,概念 是指蛋白质分子中氨基酸的排列顺序。 主要的化学键 肽键、有些蛋白质还含有二硫键。 一级结构是决定蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础，但不是决定蛋白质空间构象唯一因素。,二、蛋白质的空间结构,空间结构 指蛋白质分子内各原子围绕某些共 价键的旋转而形成的各种空间排布及相互关系，称为蛋白质的构象。 蛋白质的构象分为主链构象和侧链构象。,（一）蛋白质的二级结构,概念 是指蛋白质多肽链主链原子局部的空间排列，不涉及氨基酸残基侧链的构象。 维系蛋白质二级结构的主要化学键是氢键。,2.蛋白质二级结构的主要形式,-螺旋 -折叠 -转角 无规卷曲,（1） -螺旋,-螺旋的结构特点 多肽链以肽键平面为单位，-碳原子为 转折点，有规律的盘绕成右手螺旋结构。 每3.6个氨基酸残基盘绕一圈，螺距为0.54 nm。 相邻螺旋的肽键之间形成氢键，方向与长 轴基本平行，维持螺旋的稳定。 R基团伸向螺旋外侧，其大小、形状及电荷性质均影响-螺旋的形成。,（2）-折叠,-折叠的结构特点 多肽链呈伸展状态，肽键平面沿长轴折叠呈 锯齿状，两平面间夹角为110，R基交替地伸向锯 齿状结构的上下方。 若干肽段互相靠拢，平行排列，通过氢键连 接。氢键的方向与长轴垂直。 若两条肽段走向一致（N端、C端方向相同） ，称为顺向平行；反之，称之为逆向平行，逆向更 稳定。,-折叠包括平行式和反平行式两种类型,（3）-转角,-转角的特点 主链骨架本身以大约180回折 回折部分通常由4个氨基酸残基构成 构象依靠第一残基的-CO基与第四残基的- NH 基之间形成氢键来维系。,（4）无规卷曲,是指多肽链中除了以上几种比较规则 的构象外，其余没有确定规律性的那部分 肽链构象。,（二）蛋白质的三级结构,概念 是指整条肽链中所有原子的空间排布，它包括主链构象和侧链构象。 主要化学键 疏水键、氢键、盐键等非共价键和二硫键。疏水键是维持三级结构稳定的最主要作用力。,结构域（domain） 分子量大的蛋白质在形成三级结构时，肽链中某些局部的二级结构汇集在一起，形成发挥生物学功能的特定区域，称为结构域。 由一条多肽链形成的蛋白质，其最高级结构为三级结构。只有具有三级结构的蛋白质才具有生物学活性。,（三）蛋白质的四级结构 体内有许多蛋白质分子是由两条或两条以上具 有独立三级结构的多肽链通过非共价键聚合而成，中 每条具有独立三级结构的多肽链称为亚基。 概念 蛋白质分子中各亚基之间的空间排布和相互接触关系。 化学键 氢键、盐键、范氏引力、疏水键等非共价键。,蛋白质结构中应注意的几个问题,由一条多肽链形成的蛋白质其最高级结构为三 级，具有三级结构的蛋白质才具有生物学活性。 形成蛋白质的四级结构至少要有两条多肽链。 两条或两条以上的多肽链靠共价键连接的蛋白质没有四级结构。 由一条多肽链形成的蛋白质与亚基不同。,三、蛋白质的结构与功能,蛋白质一级结构与功能的关系 一级结构决定蛋白质的空间结构； 一级结构决定蛋白质的生物学功能。 蛋白质空间结构与功能的关系 蛋白质构象是其生物学功能的基础， 构象改变功能改变。,第三节 蛋白质的理化性质,一、蛋白质的两性解离与等电点,1. 蛋白质是两性电解质 蛋白质分子中可解离的基团 多肽两端游离的-氨基和-羧基 多肽侧链R上解离的基团 决定蛋白质解离成正负离子的因素 蛋白质所含酸性和碱性基团的数目 蛋白质所在溶液的pH值,2.蛋白质的等电点（pI） 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离 成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子， 净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电 点。蛋白质等电点性质为电泳分离的依据。,体内大多数蛋白质的等电点在pH5.0 左右，因而在生理条件下以阴离子形式存在 。,3.电泳 带电粒子在电场中向电性相反的电极移动的 现象。 蛋白质在带电场中泳动的速度和方向与其所 带电荷的性质、数量及分子的大小、形状有关。 带电荷多，分子小的泳动速度较快；反之则泳动 较慢，从而达到分离蛋白质的目的。,二、蛋白质的胶体性质,1.蛋白质有胶体性质 蛋白质是生物大分子，分子量在1万10万Da之间，分子直径在胶体颗粒的范围（1100nm），因此，蛋白质具有胶体的性质。,2.蛋白质亲水胶体稳定的因素 蛋白质分子表面的水化膜和同种电荷。去掉两个稳定因素，则蛋白质从溶液中析出而产生沉淀。 3.蛋白质胶体性质的应用 透析用于分离纯化蛋白质 超速离心用于蛋白质的分离纯化及分子量的测定。,变性的概念 在某些物理或化学因素的作用下，蛋白质 特定的空间构象被破坏，从而导致其理化性质改 变和生物活性丧失，称为蛋白质的变性。 变性的实质 次级键断裂，空间结构破坏,三、蛋白质的变性、沉淀和凝固,引起变性的因素 物理因素 高温、高压、紫外线、电离辐射、超声波等。 化学因素 强酸、强碱、有机溶剂、尿素、重金属盐等。,变性蛋白质的特点 A.生物学活性丧失 B.溶解度降低，易于沉淀 C.粘度增加 D.结晶能力消失 E.易被蛋白酶水解,蛋白质变性的应用,应用变性的因素进行消毒、灭菌。 保存生物制剂则要防止蛋白质变性。,蛋白质的复性 大多数蛋白质变性后，空间构象严重破坏，不能恢复其天然状态，称为不可逆性变性；若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素，有些可恢复其天然构象和生物活性,称为蛋白质的复性。,牛核糖核酸酶的变性与复性,蛋白质沉淀,概念 蛋白质从溶液中析出的现象称为沉淀。 方法 盐析法、有机溶剂的沉淀、重金属盐沉淀、生物碱试剂沉淀。 变性的蛋白质易于沉淀，但不一定都发生沉淀。沉淀的蛋白质易发生变性，但并不都变性，如盐析。,四、蛋白质的紫外吸收性质,蛋白质分子中含有共轭双键的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸残基，具有紫外吸收能力，在280nm处有最大吸收峰。此特性常用于蛋白质含量的测定。,五、蛋白质的免疫学性质,蛋白质作为大分子，往往具有免疫原性，同时，抗体也是蛋白质。 抗原（免疫原）：凡能刺激机体免疫系统产生免疫应答，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞受体发生特异性结合的物质。 抗体：机体中因抗原刺激而产生的能与相应抗原特异结合并具免疫功能的免疫球蛋白。 单克隆抗体：由针对某一个特定抗原决定簇而分化、增殖而来的B淋巴细胞群合成并分泌的抗体。,六、蛋白质的呈色反应,1. 双缩脲反应： 肽键与双缩脲试剂反应呈紫色；氨基酸无此反应，可用于检查蛋白质的水解程度。 碱性溶液中与Cu2+产生蓝色，mg级测定 2. 茚三酮反应: 酸性条件下，与茚三酮共热产生蓝紫色 3. Folin酚试剂反应 碱性+Cu2+磷钼酸-磷钨酸蓝色 范围:25-250g(Tyr,Trp的反应),1. 紫外分光光度法: 280nm, 0.1-0.5mg/ml (样品含核酸时)蛋白质(mg/ml)=1.55A280-0.75A260 2. 福林-酚试剂法: 碱性+Cu2+磷钼酸-磷钨酸蓝色 范围:25-250g(Tyr,Trp的反应),七、蛋白质的含量测定,3. Biuret法： 蛋白质+碱性+Cu2+BCA试剂(4,4-二羧酸-2,2-二喹啉钠)紫色(562nm) 范围:10-1200g/ml 4. Bradford蛋白分析法: 考马斯亮蓝G-250+乙醇+酸性淡红色+蛋白质蓝色(595nm) 范围:10-100g/ml,5.双缩脲法 肽键+碱性+Cu2+紫红色 范围:0.5-10mg/ml 6.凯氏定氮法 1g氮相当于样品含有6.25g蛋白质,第四节 蛋白质的分离纯化,一、蛋白质的提取 1. 选材：新鲜、富含目的蛋白且来源方便 2. 组织细胞的粉碎：胞内及膜中蛋白 物理法：如超声、匀浆、加砂研磨、高压挤压等 化学法：如EDTA、SDS等 酶法：如自溶法、外加酶法（纤维素酶、果胶酶、溶菌酶等） 3. 提取：适当溶媒、适当条件、适当提取时间和次数,二、蛋白质的分离纯化,（一）根据溶解度不同 1. 等电点沉淀:蛋白质在pI时溶解度最小 2. 盐析(分级):大量中性盐如(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl加入蛋白质溶液中,破坏蛋白质在水溶液中的稳定性因素而沉淀.各种蛋白质盐析时需盐浓度及pH不同. 3. 低温有机溶剂沉淀(分级):降低水的介电常数,（二）根据分子大小不同 1. 透析和超滤(分级):根据分子量的大小，用透析袋或滤膜将大、小分子物质分开 2. 凝胶过滤(分子排阻层析):又称分子筛，柱内填满带有小孔的颗粒，一般为葡聚糖 3. 密度梯度离心:根据粒子密度差进行分离。蔗糖,CsCl,(三)根据电离性质不同 1.电泳法:蛋白质泳动的方向和速度取决于蛋白质分子所带电荷的性质、数量及质点的大小和形状 1)醋酸纤维素薄膜电泳 2)聚丙