RSAP标记技术在花生遗传多样性检测中的初步应用.docx

目录摘要1ABSTRACT11 引言21.1 RSAP标记技术21.2 DNA提取方法21.3 PCR反应原理及成分32 材料与方法42.1 材料42.1.1 32个花生品种42.1.2 主要试剂52.1.3 主要仪器用具52.2方法52.2.1花生DNA的提取52.2.2 PCR反应体系的优化62.2.3 PCR反应条件中退火温度的确定62.2.4引物初步筛选72.2.5多样性检测73 结果及分析8 3.1 PCR反应体系的优化83.1.1 引物浓度对扩增结果的影响83.1.2 模板浓度对扩增结果的影响83.1.3 TaqDNA聚合酶浓度对扩增结果的影响93.1.4 dNTPs浓度对扩增结果的影响93.2 退火温度对扩增结果的影响103.3引物筛选结果113.4多样性初步分析114讨论124.1 RSAP特点124.2 影响RSAP因素13致谢14参考文献15RSAP标记技术在花生遗传多样性检测中的初步应用摘要：限制性位点扩增多态性(restriction site amplification polymorphism ,RSAP) 是根据基因组内普遍存在的酶切位点来设计特殊的引物,通过简单的梯度PCR反应来产生多态性。本研究首次建立了适合于花生RSAP分析的PCR反应体系和反应条件, 并对RSAP标记技术在花生遗传多样性检测中的应用进行了初步研究。利用所建立的体系，使用15对引物对32个花生DNA进行了PCR扩增,经过重复验证,有8对引物能够扩增出清晰且稳定的条带，这些条带具有一定的多态性，说明所建立的体系可用于花生遗传多样性分析。关键词：RSAP；花生；遗传多样性The Application of RSAP Marker Technique in Diversity Detection of peanutAbstract : Restriction site amplified polymorphism (RSAP) requires just a simple polymerase chain reaction(PCR)to generate polymorphic markers around restrictive site. An RSAP analytic system suit for peanut was set up and applied in diversity detection of peanut for the fist time. In this experiment, fifteen primer pairs were screened with 32 peanut varies by the RSAP analytic system; and eight of them produced stable and reproducible amplification patterns. Some of the fragments screened by the primer pairs were polymorphic, indicting that the analytic system was suit for the diversity detection of peanut.Key words: RSAP; peanut; diversity 1 引言花生是世界范围内广泛种植的重要油料作物之一，营养价值高，用途广，深受人们喜爱。中国花生世界年产量居世界第一位（万书波，2003）。随着中国加入世贸组织和现代交流的国际化，选育更加高产，高油，抗逆性强，早熟或其他专用型花生品种变得尤为重要（王传堂，1999）。传统的育种方式存在周期性长，对隐性基因控制的性状不易筛选等局限性，而我国对花生在分子生物学方面的研究还相对落后于其他作物（孙大容，1998）。因此，探索花生基因组研究方法对于花生遗传育种研究和加速野生种的利用有其重要意义，RSAP作为一种新型的分子标记技术，简便且具有潜力。1.1 RSAP标记技术RSAP ( restriction site amplification polymorphism)即限制性位点扩增多态性,是通过简单的梯度PCR 反应,针对基因组内普遍存在的酶切位点来产生多态性标记。RSAP的引物是依据SRAP ( sequence related amplified polymorphism)(序列相关扩增多态性) 的引物设计原理建立(Li G, et al., 2001) ，使用1对17-18个碱基组成的引物序列, 5端前12-14个碱基为没有特殊组成的填充序列, 3端的选择性碱基为4-6个碱基组成的限制性内切酶的酶切位点序列。依据引物内 3端选择性碱基,即基因组内限制性内切酶位点的不同而产生多态性。该技术无需限制性酶切及其它复杂步骤,仅1个简单的PCR 反应即可实现对DNA限制性位点的多态性进行检测,因此它是RFLP技术的1种简化。该技术由杜晓华等首先在辣椒中建立(杜晓华等， 2006),同时在苦瓜和水稻上作了验证，乔利仙（2007）对紫菜遗传多样性进行了多态性分析，除此之外没有其它报道。本研究首次将新型分子标记技术RSAP的PCR体系在花生分析上进行了优化，并对32个花生的遗传多样性进行了初步检测。1.2 DNA提取方法生物体基因组DNA的提取是进行核酸分子生物学研究的基础。对大部分细菌来说，主要细胞提取物就是DNA,RNA和蛋白质，因此苯酚提取或蛋白酶降解后，接下来利用核糖核酸酶来分解RNA就可得到较为纯净的DNA样品。植物全基因组的提取有一定的困难性，主要在于植物组织较难处理，它存在细胞壁，组织中含有大量的碳水混合物，这些碳水混合物不能通过苯酚提取而除去，为此我们可以加入某种去垢剂（CTAB），使其与核酸一起形成不溶的混合物。植物总 DNA 的提取方法主要有 CTAB 法和 SDS 法,针对不同植物总DNA的提取流程是不同的, 即便是同一植物提取总 DNA 的方法相同, 其技术流程也存在很大差异（Shokes FM，1987）（Bateman ,D F.，1964）改进方法的聚焦点是提高 DNA 的质量。而一味追求提高 DNA 质量,增加了许多操作环节,所以在满足试验需求的前提下,应考虑简捷可靠的 DNA 提取技术流程。本实验所用的模板 DNA 就是用经过改进的 CTAB 法(陈静等，2008)提取并初步纯化的。1.3 PCR反应原理及成分本实验的核心技术和基础步骤是PCR：多聚酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）是美国Perkin-Elmer/Cetus公司人类遗传研究室Mullis K.B等人于1985年发明的一种快速体外DNA片段扩增技术，是八十年代分子生物学资源领域的一项革命性突破，被誉为分子生物学资源发展史上的又一里程碑。该技术一问世，就在分子生物学、医学、生物工程、法医学、考古学等领域得到快速而广泛的应用，并且对已建立的基因克隆、DNA序列分析等现代分子生物学技术的发展也起了巨大的推动作用。PCR技术是一种模拟自然DNA复制过程的体外酶促合成特异性核酸片段技术（亦称无细胞分子克隆技术）。它以待扩增的两条DNA链为模板，由一对人工合成的寡核苷酸作为介导，通过DNA聚合酶促反应，在体外进行特异DNA序列扩增。其过程包括模板变性（denature）、引物退火（annealing）和用DNA聚合酶延伸（longation）退火引物在内的重复循环系列，使末端被引物5端限定的特异性片段成指数形式累积。由于在每一循环中合成的引物延伸产物可作为下一循环中的模板，因而每次循环中靶 DNA 的拷贝数几乎呈几何级数增长。因此20次PCR循环将产生约一百万倍的扩增产物，具有操作简单、快速、灵敏度高、特异性强的特点，并且具有从 DNA 粗制品和降解的 DNA 模板中扩增靶序列的能力。 PCR的原理类似于DNA的天然复制过程，关键是运用两个起始引物，分别与待扩增序列相对的两条单链 DNA 结合，结合位点分别位于待扩增序列的两端，并且 3端相对，然后利用DNA聚合酶依赖于 DNA 模板的特性，模仿体内的复制，在两个引物之间诱发聚合酶反应。在该反应体系中，各组分用量的大小对扩增是否成功会有极大影响，因此一个反应体系是否适合于对某种作物进行基因扩增，需要进行优化验证。PCR反应中的主要成份有： (1) 引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏和用量往往是PCR成败的关键。一般引物长度约为16-30bp，太短会降低退火温度，影响引物与模板配对，从而使非特异性增大，太长则比较浪费，且难以合成。引物不能与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构，以免产生非特异性扩增，影响产量。一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0mol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低则降低产量。(2) 4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)：一般反应中每种dNTPs的终浓度为20-200mol/L。理论上4种dNTPs 20mol/L，足以在100l反应中合成2.6g的DNA。当dNTPs终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性。4种dNTPs的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dNTPs的不足出现的错误掺入。 (3) Mg2+ ：Mg2+ 浓度对 TaqDNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+浓度范围为0.5-2mmol/L。对于一种新的PCR反应，可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。在PCR反应混合物中，应尽量减少高浓度的带负电荷的基团,例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+浓度的物质，以保证最适Mg2+浓度。(4) 模板：PCR反应必须以DNA为模板进行扩增，模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好)。就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。扩增多拷贝序列时，用量更少。模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。(5) Taq DNA聚合酶：一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5 130min，95 40min， 97 5min。现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶，这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间。Taq DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率,在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意。在100LPCR反应中，1.5-2U的Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环。所用的酶量可根据 DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减。酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。2 材料与方法2.1 材料2.1.1 32个花生品种：白皮2、新泰四因子、野杂一号、兰娜、西洋生、紫（Krapts）、黑皮920、白沙13、白沙131-17、白沙261-3、白沙1016、四粒红、8823、HH2、W、花17、花37、丰华3、花育20、花育23、鲁花7、鲁花8、鲁花9、鲁花12、潍花8、伏旱1、伏旱2、青岛9616、刑8715、徐州68-4、杂选4、丰华3号2.1.2主要试剂EB、溴酚蓝、琼脂糖、氯仿、异丙醇、异戊醇、无水乙醇、ddH2O、dNTPs、Taq酶、10Buffer、6lodding Buffer、 CTAB、20TBE、20过硫酸铵、75乙醇、亲和硅烷、TaqE、dNTPs50TAE配方：Tris 242g、Na2EDTA2H2O、醋酸 57.1ml，加ddH2O定容至1L20TBE配方：Tris 216g、硼酸 110g、Na2EDTA2H2O 14.88g，加ddH2O定容至1L40丙烯酰胺：丙烯酰胺 380g、N、N-亚甲叉丙烯酰胺 20g 加ddH2O至600ml,将溶液加热至37使试剂溶解，用蒸馏水将体积调至1L，用硝酸纤维素滤膜过滤溶液，室温保存于棕色瓶中6丙烯酰胺：尿素 450g、40丙烯酰胺150ml、10TBE100ml加ddH2O至1L亲和硅烷：无水乙醇99ml、冰乙酸 500L、binding 原液 500L硝酸银染色液：1.5g硝酸银溶于1LddH2O水中显色液：NaOH 20g、Na2CO3 0.4g、甲醛 4ml加ddH2O至1000ml甲酰胺染料：去离子甲酰胺 98、EDTA 10mM、溴酚蓝 0.025 、二甲苯青 0.0252.1.3主要仪器用具琼脂糖电泳设备、聚丙烯酰胺电泳设备，水浴锅、离心机、灭菌锅、移液枪、枪头、离心管、试管、EP管、烧杯、玻璃棒、紫外灯、培养瓶、酒精灯、一次手套、PCR仪（Takara,TP600）2.2方法2.2.1花生DNA的提取取花生叶片0.2-0.3g于1.5ml离心管中，加液氮研磨充分；加入500ul65预热的CTAB,混匀后65水浴30min；取出放置冰上冷却后，加入500L氯仿：异戊醇（24：1）冰上放置10-30min；12000rpm离心10min，取上清液于另一试管中；加入等体积的苯酚：氯仿（1：1）抽提液，充分混匀冰上放置1min，12000rpm10min；取上清液于另一试管中，加入等体积-20冷却的异丙醇，颠倒混匀，-20放置1h；12000rpm离心10min，弃上清；70乙醇洗涤过夜；10000rpm离心5min，吸干后吹干；加入20-30L TE溶解；1琼脂糖凝胶电泳检测。2.2.2 PCR反应体系的优化为确定适宜的PCR 扩增体系, 本研究以RSAP适用于辣椒的 PCR 反应体系 (杜晓华等， 2006)以及花生的序列相关扩增多态性（SRAP）扩增体系（张建诚等，2005）为基础，初步采用下述体系扩增，并逐步对引物浓度，模板浓度聚合酶浓度及dNTPs浓度进行优化。表1初始扩增体系试剂使用浓度终浓度ddH2O-10buffer20mM Mg2+2mMdNTPs2.5mM0.2mMPrimer1,210uM650nMTaqE5U/uL1Utemplate60ng30ng在上表终浓度基础上进行浓度梯度试验（1）引物浓度：终浓度分别为500，550，600，650，700 nM（2）模板浓度：终浓度分别为60，50，40，30，20，10，5 ng （3）聚合酶浓度：终浓度分别为0.75，1, 1.25 1.5，1.75U（4）dNTPs浓度：终浓度分别为0.2， 0.25，0.3，0.35 mM2.2.3. PCR反应条件中退火温度的确定退火温度的确定借鉴限制性位点扩增多态性（Restriction site amplified polymorphism RSAP)适用于紫菜的PCR程序（乔利仙，2007）， 具体如下: 94 变性5 m in；94 1 m in, 35 1 m in, 72 1 m in, 5 个循环； 94 1m in, 46 1m in, 72 1min, 35 个循环;72 10 m in, 4 保存。为确定最佳退火温度,在第二轮扩增中 ，试验将后35 个循环的退火温度分别设为46,47,48,49,50 , 进行PCR 扩增。2.2.4引物初步筛选表2 RSAP分析所用的引物引物Primers序列Sequence 5to 3限制酶切位点Restriction site限制酶R1ATTACAACGAGTGGATCCGGATCCBam H R2GACTGCGTACATGAATTCGAATTCEco R R3TATCTGGTGAGGGATATCGATATCEco R R4TTGGGATATCGGAAGCTTAAGCTTHin d R5ATAGTCCTGAGCGGTTAATTAAMse R6ATTGGACTGGTCTCTAGATCTAGAXba 本试验选取了6个引物，各引物可随机组合共得到21个引物组合，对这21对引物进行了初步筛选，步骤如下：（1）运用上述实验所建立的反应条件和PCR反应体系，用21对引物进行扩增。（2）2琼脂糖凝胶电泳检测，电极缓冲液采用1TAE，稳压100V，30min。溴化乙锭染色。2.2.5多样性检测用所筛选的引物对32个花生DNA进行PCR扩增，检测这些品种间的遗传多样性。扩增产物用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。凝胶制备电泳步骤(萨姆布鲁克 2002)：（1）玻璃板用自来水、洗涤剂冲洗后再用75无水乙醇淋洗，电扇吹干后，涂上亲和硅烷，风扇吹干； （2）有机玻璃板用自来水冲洗、无水乙醇淋洗，电扇吹干，涂上剥离硅烷，电扇吹干；（3）用支架将两块玻璃板固定，底板用透明胶封住（留下灌胶孔），灌胶孔用白胶布粘住备用；（4）取80mL 6丙烯酰胺，加240L 20过硫酸铵，再加80LTEMED,混匀后吸入注射器；注射器气泡赶出后将凝胶注入胶板；（5）插上梳子，放置1-2小时完成聚合；（6）底板去掉后，把凝胶板放入电泳槽中，去掉梳子，加入1TBE,使缓冲液覆盖样品孔，接通电源预电泳30min(60W,1300V)（7）PCR样品处理：样品中加入等体积或一半体积的loading buffer,94变性5min后开盖置于冰上；（8）暂停电泳，每孔上样5L；（9）电泳90min后硝酸银染液染色15至30min,蒸馏水冲洗数次后，显色液显色15至30min；（10）自来水冲洗、晾干，照相。3 结果及分析3.1 PCR反应体系的优化3.1.1 引物浓度对扩增结果的影响引物用量少，与模板DNA结合效率低，产物的产量就会受到影响。引物用量过大，也有不利影响；第一，会增加非特异性结合的机率；第二，也会增加引物之间形成引物二聚体的概率；第三，引物也可以和TaqDNA聚合酶竞争结合Mg2+。引物浓度的变化必然会影响引物与模板DNA结合的机会，从而影响扩增效率。本实验结果表明，宜采用600nM。 1 2 3 4 5 图1 引物浓度对扩增结果的影响1-5引物浓度依次为：500，550，600，650，700 nM3.1.2 模板浓度对扩增结果的影响模板量为20-60ng 在中均能获得扩增得到目的条带, 且电泳带型基本一致, 说明RSAP技术对模板DNA 量的要求范围较宽。同时也发现, 模板量为10ng左右时条带已较淡, 表明模板浓度过低(10ng)不太适宜。 过低使起始拷贝数少, 影响扩增产物量, 过高则可能因蛋白或其他杂质会妨碍扩增, 导致产物量减少。推荐在花生RSAP分析中使用30-40ng， 1 2 3 4 5 6 7图2 模板浓度对扩增结果的影响1-7模板浓度依次为：60，50，40，30，20，10，5 ng3.1.3 TaqDNA聚合酶浓度对扩增结果的影响TaqDNA聚合酶的用量过大会造成浪费，并且会导致非特异性扩增；用量小，会影响扩增效率，降低扩增产物的产量(Fang X.J.,2001)。TaqDNA聚合酶的用量会受到反应体系体积、酶活性及酶耐热性等因素的制约。该结果表明，终浓度1.25U为佳。1 2 3 4 5 图3 TaqDNA聚合酶浓度对扩增结果的影响1-5 TaqDNA聚合酶浓度依次为：0.75，1 1.25 1.5，1.75U3.1.4 dNTPs浓度对扩增结果的影响dNTPs为PCR反应提供底物，使得产物得以延伸。因此，dNTPs用量过低，就会影响PCR效率，甚至使dNTPs耗尽，导致产物单链化，影响产物产量；另一方面，dNTPs用量过高，会导致TaqDNA聚合酶的错误掺入，影响扩增的准确性；另外dNTPs可以1:1的结合Mg2+，其用量细微的变化，就会显著的降低Mg2+浓度，从而会抑制Taq DNA聚合酶的活性，影响PCR效率，甚至会阻止反应进行，该结果表明，适宜选用的dNTPs浓度为0.2mM。1 2 3 4图4 dNTPs浓度对扩增结果的影响1-4 dNTPs浓度依次为：0.2， 0.25，0.3，0.35 mM3.2 退火温度对扩增结果的影响反应程序方面，退火温度对扩增结果的影响较大。退火温度过低会造成引物和模板DNA之间的错配，产生非特异性产物；退火温度提高会提高产物的特异性，但过高会阻碍引物和模板DNA之间的配对，减少产物的产量，甚至无产物。所以此项验证表明47为佳。1 2 3 4 5图5 退火温度对扩增结果的影响1-5退火温度依次为：46，47，48，49，503.3引物筛选结果用建立起来的反应体系和反应条件，对21种引物组合进行扩增，表明有的引物不能扩增出清晰条带，这可能与花生基因组中限制性酶切位点的位置有关。其中有8对引物有明显的条带，有一定多态性，这8对引物分别为：R1/R3, R2/R3, R2/R5, R3/R4, R3/R6, R4/R5, R4/R6, R5/R6。图6 引物筛选结果图中：1,2为引物R1/R3 3,4为引物R1/R5； 5,6为引物R1/R63.4多样性初步分析 初始扩增体系的扩增条带不太清晰，优化后的体系明显好于初始体系。用优化后体系对32个花生品种进行PCR扩增，得到10余条扩增产物，而且扩增产物显示了一定的多态性，扩增效果较好，说明该体系可以用于花生遗传多样性分析。 1 10 20 30图7 初始扩增体系的扩增结果 图8 优化后扩增体系的扩增结果4讨论4.1 RSAP特点RSAP参照了SRAP 分析的原理和方法,设计了独特的引物和专一的梯度 PCR 扩增程序,无需限制性酶切及其它复杂步骤, 仅一个简单PCR 反应即可实现对 DNA 限制性位点多态性进行检测。与SRAP 分析相似,RSAP 前5个循环采用较低的退火温度(35) ,以保证引物通过部分匹配与模板相结合,提高扩增的效率;后30 个循环采用较严谨的退火温度(47) ,对已扩增片段进行特异性扩增,以保证扩增产物的稳定。引物的设计借鉴了RAPD 随机序列的模糊匹配原理,形成了以酶切位点为核心的序列,结合5端随机序列的部分错配引物结构,从而实现了对限制性位点的选择性扩增。引物长度设计为17-18 bp ,保证了扩增结果的稳定可靠。从操作步骤上讲, RSAP 技术是 AFLP 的极大简化;从基因组的扩增区域上讲,RSAP 是对SRAP 标记的有效补充。因为SRAP 主要针对单拷贝区扩增,而RSAP 扩增的限制性位点则散布于整个基因组区。RSAP 引物可两两随机配对,产生较多对引物,降低了引物的合成成本, 加上步骤简单和检测位点较多,RSAP 技术具有一定的成本优势。4.2 影响RSAP因素RSAP是一种新型分子标记,其反应条件受到多种客观因素影响,而且在不同的物种中有较大差异，所以直接借鉴别人所用的反应体系极少能得到好的扩增效果，同时它又是一种操作简单、产率中等、稳定可靠的DNA 标记技术。该实验表明对花生来说其适宜的退火温度为47，温度太高不易产生扩增条带,温度太低则易产生非特异性条带。 在15ul PCR 反应体系中, 模板DNA浓度为30-40ng(栽培种)较为适宜。除了对材料中的32品种进行模板浓度分析外，该试验也对部分野生种 DNA 进行扩增。对于野生种来说，因为其作为模板的 DNA 是用种子提取，可能含有大量妨碍扩增的脂肪等杂质，所以常规浓度的模板样品可能因限制性位点被包被而无法扩增出条带。该试验野生种能扩增出条带的模板浓度仅为5-15ng， 因该实验借鉴的基础体系中缓冲液对扩增无明显影响，所以Mg2+(buffer) 浓度依然采用2 mmol/L , dNTPs 浓度为0.2mmol/L , Taq DNA 聚合酶量为1.25 U , 2 条引物均为600 nmol/L 。扩增程序中除去退火温度对扩增效果影响较大外，循环数也很重要，但该实验初始采用的循环数为35，理论上不会有问题故未进行梯度改变。另外操作的规范性，仪器的性能，试剂的质量等均会造成结果偏差。该研究表明RSAP标记技术操作简便、产率中等、结果稳定可靠，成本低廉,在花生遗传多样性分析和加速野生花生资源的利用率上都具有广阔前景。 致谢从试验的进行到论文的写作都是在乔利仙老师的悉心指导下完成的。乔老师严谨的治学、工作作风以及对学生严格要求，认真负责的态度，使我深受启迪并将终身受益。在老师的教导和帮助下我在理论和实践技巧上都有了很大的提高，同时也锻炼了独立思考和动手的能力，所有这些都是我人生道路上的财富，在此谨向乔老师致以最真诚的谢意。同时要真挚感谢王晶珊老师在实验进程中的大力支持及其在论文设计和完成的过程中给予的指导。此外，还要向在实验过程中给予我极大帮助的师哥郝世俊、师姐雷萍萍以及徐蕾，李九安等同学表示感谢，感谢你们对我的帮助和支持，使我的试验顺利进行。参考文献陈静