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医学真菌生物膜研究进展 Biofilms: a New Perspective on Fungal Infection,第二军医大学长征医院皮肤科 廖万清,医学真菌学,它是研究病原真菌和条件致病真菌对人类致病机制、诊断、治疗和预防的一门重要学科，属交叉、边缘学科。,真菌,酵母,丝状真菌,念珠菌,隐球菌,球拟酵母菌,微型丝状真菌（霉菌）,巨型丝状真菌（如香菇）,真菌按其菌落形态分为,特征：多细胞，有菌丝和孢子，基本形态是菌丝,特征：在感染组织内寄生或在37高营养培养基培养时是酵母相，在体外腐生和27培养时呈菌丝相,皮肤癣菌,真菌的致病方式,真菌毒素中毒症：黄曲霉毒素, 镰刀菌毒 素。 变态反应性疾病：多形性红斑，外源性变态反应性肺泡炎。 浅部真菌病: 皮肤及附属器官感染。 深部真菌病: 局限性及系统性。,各种原因导致真菌感染患者增加,美国流行病学研究发现,1980至1982年与1992至1993年相比,念珠菌病发病率由2.6/100万/年上升至72.8/100万/年;隐球菌病由4.0/100万增至65.5/100万/年;曲霉病由8.4/100万/年增至12.4/100万/年。 北京协和医院1953至1993年间尸检结果显示，后20年深部真菌感染率由1.5%增至5.6%。,上述原因导致机会致病真菌感染的病例大幅增加，有许多感染反复难愈。其中有相当多的病例已经证实与真菌的生物膜形成有关。,一. 生物膜的形成和结构,生物膜(biofilm) 定义：是一种附着于活组织或无活力的组织表面、由其自身产生的细胞外多聚基质(extracellular maxtrix,ECM)包裹的有结构的菌细胞群体，由ECM以及被其粘连的菌细胞构成。 它是相对于游离状态菌细胞而言的另一种微生物的存在方式。它可以保护菌细胞，明显降低隐球菌等致病真菌对抗真菌药物的敏感性，甚至耐药。,近年来已发现包括主要的人类致病真菌在内的多种真菌可以形成生物膜。 念珠菌可以形成生物膜且念珠菌形成的生物膜有对抗宿主防御机制的作用，并使得念珠菌对临床常规抗真菌药物明显耐药。Walsh等则最早报道了一个隐球菌生物膜形成的病例，该病人在心室心房分流术后心导管表面生长的微生物薄膜经培养确定为新生隐球菌，薄膜超微结构符合生物膜的结构特点，首次证实新生隐球菌也可以产生生物膜。Reynolds 发现酿酒酵母生物膜的存在。, 菌体与支撑物表面的粘附。 形成微菌落。 微菌落融合并释放基质形成生物膜的基底层。 基质大量释放；同时伴随菌丝和或假菌丝的形成,结构逐渐复杂。 细菌或真菌细胞从生物膜释放出来，形成新的生物膜,早 期,中 期,成熟期,生物膜的形成过程,(c)成熟期,白念珠菌生物膜 (生长于聚甲基丙烯酸甲酯片上，荧光显微镜下),(a)早期,(b)中期,生物膜的结构,以白念珠菌生物膜为例。 最初的2h：白念珠菌细胞主要以芽生孢子的形态附着于支撑物表面。 4h后：开始形成芽管，出现分散的微菌落，并逐渐融合。 中期的开始阶段(1214 h)：主要是以细胞外基质的出现为特点，细胞外基质覆盖在真菌微菌落表面，随时间推移不断增多，直至将细胞完全包裹。 成熟期：形成在细胞外基质包裹下的由孢子、菌丝和假菌丝组成的致密的网状系统，呈有机的三维结构。,白念珠菌生物膜(生长于义齿树脂表面，共聚焦扫描激光镜下)： 0 (a), 8 (b), 11 (c), 48 (d) 小时,标尺均为10m,白念珠菌生物膜 (长于盖玻片，24h，扫描电镜下) 注：扫描电镜操作前的处理 去除了大部分基质,新生隐球菌的生物膜 早 期：酵母细胞和出芽孢子形成单层结构； 中 期：逐渐形成菌落； 成熟期：产生大量荚膜多糖和细胞外物质，将大量酵母细胞连成三维网状结构。,早期：A、B 出芽、单层生长 中期：C、D 微菌落形成 成熟期：E、F 荚膜多糖释放、细胞外基质形成并包裹数层酵母细胞,C. neoformans B3501生物膜 (生长于聚苯乙烯96孔板，光镜下),成熟的C. neoformans B3501生物膜(生长于盖玻片，电镜下) 可见多糖物质将酵母细胞连接在一起(箭头所示)。,二. 生物膜形成的影响因素,生物膜的形成受到多种因素影响：附着组织类型、血清成分等，在体外培养则还受到培养基类型的影响。如下所述。,血清及组织液成分,血清及组织液的某些成分可促进生物膜形成。 在相同材质的支撑物上，相较与体外生物膜，体内生物膜的胞外基质更厚，而且体内生物膜完全成熟所需要的时间更短。,容量感应(Quorum-sensing),近年来的研究表明，容量感应分子在生物膜形成上的重大作用，它使得生物膜不再是浮游细胞的简单聚集。白念珠菌的容量感应分子有法尼醇(Farnesol)和酪醇(tyrosol)。 其中法尼醇与生物膜形成有关，另外它还可以抑制白念珠菌的菌丝化。,实验证实，用法尼醇处理白念珠菌的黏附细胞群落可以抑制其生物膜的形成和生长，其作用依赖于浓度和法尼醇处理时的黏附时间。 在经法尼醇处理的白念珠菌所形成的生物膜中，有274个基因的表达发生改变，包括菌丝形成相关基因、细胞壁维持相关基因、细胞表面疏水性相关基因以及离子运输相关基因等。,法尼醇是否通过抑制菌丝化来抑制生物膜的形成目前尚不清楚。 目前仅有少量证据：敲除组氨酸激酶基因可以使受法尼醇抑制的白念珠菌同时恢复菌丝生长和生物膜形成。,细胞表面成分,隐球菌生物膜是由大量多糖基质以及分布其中的酵母细胞组成。 隐球菌生物膜的形成依赖于荚膜多糖的释放及其对支撑物的粘附能力。,携带alpha放射源的抗荚膜多糖抗体(IgG1)可以穿透隐球菌生物膜并使生物膜代谢活性下降50%，而非特异性单抗则无这一效果。,人类外周血单个核细胞（PBMCs）,PBMCs的存在可以促进白念珠菌生物膜的形成。而且它们并不象吞噬游离真菌细胞一样吞噬生物膜内的真菌细胞。只有活化的PBMCs才影响生物膜形成，这一作用由PBMCs释放的可溶性因子介导，具体成分尚不清楚。,乙醛还原酶(ADH),ADH可以抑制念珠菌生物膜。 但在许多细菌(如金葡菌)生物膜中，ADH的作用刚好相反。细菌生物膜中ADH表达增加，活性增高，产生的乙醇增多。 因此，细菌生物膜有可能通过ADH表达的调节抑制真菌生物膜的形成和发展。这可以做为细菌和真菌之间的一种竞争手段。,其它相关基因,以白念珠菌为例，还有许多基因有在生物膜的形成和发展中起作用。,三. 生物膜形成对真菌耐药性的影响,形成生物膜后，真菌对氟康唑、伊曲康唑、咪康唑、酮康唑、两性霉素B、氟胞密啶等临床常用抗真菌药物和洗必泰等消毒剂的敏感性大大下降。 特点： 1. 耐受的药物浓度超出游离细胞MIC的30-2000倍。 2. 耐药性在生物膜形成的早期就出现。 3. 随生物膜的成熟而增强。 生物膜耐药的机制尚不明了，多数学者认为生物膜耐药是由多种因素决定的。,生物膜细胞的低生长率,在生物膜里，细胞的生长速度已经被认为是影响药物敏感性的一个重要调节因素。事实上，所有的抗生素对快速生长的细胞更有杀伤力。由于营养获得的限制，生物膜细胞处于缓慢生长状态，导致真菌的代谢降低，尤其是在生物膜的基层，因此表现出细胞对抗菌药物不敏感。 但这显然不能完全解释生物膜抵抗超出正常MIC数十甚至上千倍浓度的耐药性。,药物渗透率,生物膜确实有减缓药物渗透的作用。但在用念珠菌各菌种生物膜所做的实验中，加入药物3-6h后生物膜边缘的药物浓度已达到或超过MIC却不能杀死生物膜细胞。 包含白念珠菌和表皮葡萄球菌的混合生物膜中，药物渗透更缓慢。但是即使是这样，在生物膜边缘的药物浓度也常常超过MIC。 因此药物渗透不足并不是念珠菌生物膜主要的耐药机制。,流出泵,在游离条件下，白念珠菌抵抗唑类药物的主要机制之一是由ABC运载体*和主要辅助因子#介导的药物流出泵，即cdr1、cdr2和mdr1。研究表明，在生物膜中两类流出泵基因均过表达。,* ATP-binding cassette transporters， CDR基因编码 # major facilitator, MF，MDR基因编码,缺乏流出泵的菌株所形成的早期生物膜对氟康唑的敏感性大幅增加。但在生物膜逐渐成熟后，缺乏药物流出泵的菌株同样耐药。 因此，药物流出泵只在生物膜形成早期起作用。 用罗丹明(Rh123)流出检测分析流出泵的功能也证实了这一点，即在早期阶段，生物膜与游离细胞的Rh123保留量有较大差别，而在后期(12h、48h)则无。,耐药株的存在,有学者主张生物膜内存在着耐药的亚群，其生物学特性与普通菌细胞不同，由于耐药亚群的存在使得药物无法完全清除生物膜。 证据：早期白念珠菌生物膜中的真菌细胞存在着两种亚群，它们对洗必泰的敏感性不同，拥有菌丝或假菌丝的细胞比酵母细胞更敏感。 这一现象有待进一步研究、证实。,附着面粗糙度,有人发现植入物(钛)上的白念珠菌生物膜对两性霉素B的耐药性与植入物的表面粗糙程度相关。过于粗糙或过于光滑都会降低生物膜的耐药性。 其机理尚不明。,MAP激酶 mkc1p,有丝分裂原激活蛋白(mitogen-activated protein, MAP)激酶 mkc1p活性低的白念珠菌株可以正常产生生物膜，游离细胞对氟康唑的敏感性也不变，但生物膜对氟康唑的敏感性却较之野生株有极大的提高。 即：mkc1仅增加生物膜的耐药性，对游离细胞无影响。 这是目前已知唯一有生物膜特异性的耐药基因。,四. 生物膜抵抗免疫系统的作用,有证据表明，新生隐球菌生物膜可有效抵抗巨噬细胞产生的氧化性抗微生物分子。 另外，体外研究表明，白念珠菌生物膜内存在的人PBMCs(包括单核细胞和巨噬细胞)不仅不吞噬念珠菌细胞，反而对其生物膜的生长有促进作用。 这些现象都提示生物膜对宿主的免疫有抵抗作用，生物膜的形成可能是隐球菌形成长期感染的原因之一。,五. 对抗生物膜形成的可能措施,预防生物膜形成,抗荚膜多糖抗体可以抑制生物膜提示体液免疫可能在抑制有荚膜的微生物生物膜形成方面有一定作用；相关疫苗和微生物多糖的抗体可能用于防止起搏器等植入物的生物膜形成。 已有研究证明植入物表面的粗糙程度对真菌生物膜耐药性有影响，对植入物材料的研究和改良也有可能在将来减少真菌生物膜形成。,对已形成的生物膜的用药策略,1. 联合用药 无论是抗真菌药联合使用或是抗真菌药物与抗细菌药物联用均可有效对抗生物膜的耐药性。 我们曾通过对20株新生隐球菌临床分离株进行M27-A药敏检测,证实伊曲康唑与两性霉素B联合用药可明显低真菌MIC值(见表)。且多数受试菌株表现为协同作用或相加作用未观察到拮抗作用。 伊曲康唑及两性霉素B对20株新生隐球菌MIC值平均数 （g/mL） 单用 联合使用 伊曲康唑 0.2730 0.1195 两性霉素B 0.6830 0.2102,联合抗细菌药大幅提高两性霉素B的抗念珠菌生物膜效力,注：所有菌株均为临床分离株。,2. 新型抗真菌药物的应用 新一代的抗真菌药物如棘白菌素类(卡泊芬净、米卡芬净、安多芬净)以及两性霉素B脂质体均对真菌生物膜有效。 棘白菌素主要抑制真菌细胞壁1,3-D葡萄糖苷的生物合成。已有研究证实其具备杀灭白念珠菌、新生隐球菌等真菌生物膜的能力。,寻找新的治疗靶点,某些化合物可抑制pmt1p的酶活性，可以阻断生物膜形成的早期阶段，因此可能用于阻止白念珠菌的定植和生物膜依赖的耐药。 Pmt酶蛋白以双聚体形式存在，结合方式涉及一个共同的保守的蛋白质区域，它对PMT复合物的形成和/或稳定性都是必需的。这一PMT蛋白相互结合的位点为我们提供了一个攻击真菌O-甘露糖基化过程的靶点。 Mk