细胞融合与单克隆抗体.ppt

第三章 细胞融合与单克隆抗体,3.1 细胞融合(cell fusion),定义:在离体条件下用人工的方法把 不同种的细胞通过无性方式融 合成一个杂合细胞的技术。,3.1.1细胞融合的发展历史,“自发”细胞融合现象：,1838年 Muller 多核的肿瘤细胞,1858年 Virchow 正常组织、发炎组织及肿 瘤组织多核细胞,1873年 Luginbuhl 天花病人多核体血细胞,1875年 Lange 蛙类血液细胞发生合并,重要事件,1962年,(日)冈田善雄 仙台病毒促细胞融合,70年代,(华裔加籍)高国楠 PEG促植物原生 质体的融合,80年代，电融合,植物细胞融合：,1972年（美）P.S.Carlson杂种烟草,现代植物细胞融合的开始,1978年（德）梅歇尔斯“potomo”,“Pomoto ”,3.1.2 植物原生质体培养与细胞融合 (Protoplast and Cell fusion),植物原生质体培养 植物细胞融合,3.1.3 动物细胞融合,动物细胞融合是研究细胞遗传信息转移，基因在染色体上的定位以及创造新细胞株的有效途径。,肿瘤细胞与树突状细胞的融合,人纤维肉瘤细胞与小鼠畸胎瘤细胞融合,1978年,(瑞士)埃勒门斯,(美国)柯路斯,3.1.4 细胞融合的诱导,诱导融合的方法:,物理法:电场刺激 激光 显微操作,化学法:聚乙二醇(PEG)结合高pH、 高钙离子法,生物法:仙台病毒,不同细胞融合的条件及其主要应用,仙台病毒诱导,仙台病毒(Sendal virus),也称日本血凝病毒HVJ，属粘病毒副流感类群，是RNA病毒，多型颗粒状，易在小鼠中蔓延。,融合的可能机制：,病毒被膜含有糖蛋白，其表面还分布有许多具有神经氨酸酶和凝血活性的突起，神经氨酸酶可降解细胞膜上的糖蛋白，使细胞膜局部凝集，再通过膜上蛋白质分子的重新分布，使膜中的脂类分子重排，而打开质膜，导致细胞融合。,仙台病毒诱导,融合过程：,1. 病毒颗粒附着细胞膜上起搭桥作用，使细胞 粘着成堆，在4冰浴中细胞紧密靠近，但不 发生融合。 2. 37 温浴后，粘结部位的细胞膜破坏，形成 通道，细胞质流通、融汇。 3. 病毒颗粒进入细胞质，此时两个细胞合并、 变圆，完成融合，全过程约1530分钟。 4. 细胞核也相互合并,完成细胞融合,仙台病毒诱导,仙台病毒诱导,PEG诱导,PEG聚乙二醇(polyethylene glycol),商品名：卡波蜡(carbowax),多聚化合物，分子式H(OCH2CH2)nOH,实验室用PEG平均分子量在20020,000 一般：1,000固体 常用分子量：40006000,PEG诱导,融合的可能机制,？脱水作用能使细胞凝聚，并使膜结构发生 变化,？改变膜表面电荷或膜电位，而导致膜上蛋 白质颗粒聚集及膜脂分子随之发生重排之 故。,？,PEG诱导,初步分析,可能是由于带有大量负电荷的PEG分子和原生质体表面的负电荷间，在钙离子的连接下形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着和结合，在高pH、高钙离子溶液的作用下，将钙离子和与质膜结合的PEG分子洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。,PEG诱导,PEG诱导过程注意事项：,PEG诱导,悬浮法：将细胞悬于4050的PEG4000进行 溶，处理12分钟为宜。,离心法：先将细胞混合物悬于3040的 PEG4000，再离心进行融合，则可适 当延长融合时间，以58分钟为宜。,控制与分子量、浓度和处理时间,PEG诱导注意事项：,辅以515的DMSO或在融合前用 PHA处理一下，效果更好。,pH值以pH7.48.0为宜，或略偏碱性 pH8.08.2。,PEG诱导,PEG融合法优点,效率高 材料方便，操作简易 效果稳定,PEG诱导,PEG融合法缺点,对细胞有毒性,PEG诱导,物理电融合诱导,电融合诱导,机制,在直流电脉冲的诱导下, 原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位变化, 使原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂,进而质膜开始连接,直到闭合成完整的细胞融合体,电融合诱导法原理示意图,电融合诱导,电融合优点：,融合效率高，可达5080,产生杂交细胞的频率高，是PEG法的100倍。,操作简便、稳定，但需设备。,对细胞无毒害作用。,可在显微镜下观察操作。,电融合诱导,融合率,融合细胞的细胞核总数,视野内全部细胞的细胞核总数,100,融合率=,植物细胞融合基本过程,去除细胞壁以获得大量的原生质体 诱导细胞融合形成杂种细胞 细胞相互靠近 形成细胞桥 最关键的一步 胞质渗透 细胞核融合 筛选,培养,促进细胞分裂,分化, 从细胞团,愈伤组织到最后成株,动物单个细胞的获得,动物细胞融合基本过程,组织的获得,组织的消化,诱导细胞融合形成杂种细胞,筛选，培养,植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较,影响细胞融合的因素,(1) 亲本细胞表面性质，表面覆盖绒毛而不规则 者较易融合；表面光滑者较难融合。,(2) 细胞种类不同，融合效果不同，如腹水癌及 株化细胞较易融合，而淋巴细胞或血球细胞 几乎不融合。,(3) 细胞融合时需要适宜温度和运动状态。如仙 台病毒诱导欧利希氏腹水癌细胞融合时，于 37 振摇时易于融合，且融合效率与病毒量 呈正比。但在34 振摇则融合率下降。在 37时不振摇则几乎不融合。,影响细胞融合的因素,(4)细胞融合过程中，通常耗氧量较大缺氧时经常 不融合。空气中含氧量大于20时有一定融合率，但有些细胞在无氧条件下也可融合。,(5)有些细胞融合时需要Ca2+，否则不融合，细胞蛋 白质亦发生变化。实验表明Sr2+、Ba2+、Mg2+、 Mn2+等离子可代替Ca2+但有效浓度较Ca2+大 的多。融合时最适合的离子强度一般为0.1mol/L,(6)最适合的pH为7478之间，在此范围之外， 融合率均较低。,影响细胞融合的因素,融合细胞的特征及其意义,染色体组不稳定，尤其种间杂交细胞,培养过程中染色体会逐渐丢失,理论研究基因定位和绘制基因图工作中 十分有用 应用价值单克隆抗体 植物育种,融合细胞类型,同核体（homokaryon）,异核体(heterokaryon）,多核体（polykaryon）,异胞质体(heterocybrid),同核体(homokaryon),同源细胞的融合体。由于是同源细胞，它们的基因型及表现型完全一样。,异核体(heterokaryon),非同源细胞的融合体。一般是亲源关系较近的细胞，这种亲和杂种细胞含有双亲全部细胞核和细胞质物质，其发育的个体也是可育的，如烟草属种间的细胞杂种。,多核体(polykaryon),含有双亲不同比例核物质的融合体。亲源关系较远的细胞间融合，融合体以一个细胞的核物质为主，只加入另一细胞少量遗传物质，如胡萝卜与羊角芹形成部分亲和的杂种细胞。,异胞质体(heterocybr