生物化学第9章酶促反应动力学.ppt

第9章 酶促反应动力学,一、化学动力学基础 二、底物浓度对酶反应速率的影响 三、酶的抑制作用 四、温度对酶反应的影响 五、pH对酶反应的影响 六、激活剂对酶反应的影响,(kinetics of enzyme-catalyzed reaction),研究酶促反应动力学的意义,酶促反应动力学是研究酶促反应的速率以及影响此速率的各种因素的科学。在研究酶的结构与功能的关系以及酶的作用机制时，需要动力学提供实验证据；为发挥酶催化反应的高效率，寻找最有利的反应条件；为了解酶在代谢中的作用和某些药物的作用机制等，都需要掌握酶促反应速率的规律。,二、底物浓度对酶反应速率的影响,酶反应速率对底物浓度作图,中间复合物学说,为了解释这个现象，Henri和Wurtz提出了酶底物复合物学说。该学说认为，当酶催化反应时，酶首先与底物结合，生成酶底物复合物，然后生成产物，并释放出酶。反应用下式表示： S + E ES P + E,酶底物中间复合物存在的证据,电子显微镜和X光衍射直接观察到酶与底物的复合物。 酶与底物结合后光谱发生变化。 溶解度或热稳定性在加入底物后发生变化。 分离到了酶底物复合物。 超离心沉降过程中，可观察到酶和底物共沉降的现象。 平衡透析时，观察到底物在半透膜两侧浓度不相同(半透膜的一侧有酶，另一侧无酶，有酶一侧底物浓度高于无酶一侧)。,（1）平衡学说,（Henri，Michaelis和Menten方程）,1902年Henri和Brown提出了酶催化的反应机理 1913年Michaelis和Menten完善了这个理论，他们认为酶反应的第一步是快速可逆的平衡，第二步慢，为限速反应。,平衡学说推导反应速度方程的假设前提,在推导动力学方程时，有几点假设： 第一步迅速平衡，第二步慢，即 k3 E，S ES。 酶以E和ES两种状态存在。,根据平衡学说推导速度方程,设Vf 为E与S结合的速度，Vr 为ES解离的速度，则Vfk 1 ( E0ES )( SES ) Vrk 2 ES 平衡时VfVr k 1 ( E0ES )( SES ) k 2 ES 又 S ES SESS,根据平衡学说推导速度方程,k1 ( E0ES ) S k 2 ES 解出 ES 得,令 ， 则,根据平衡学说推导速度方程,由于V = k 3 ES，代入前式 得 因为当所有的E都成为ES时，可达最大反应速度，即Vm = k 3 E0 ，所以 这就是米氏方程。,米氏方程,米氏方程是一个双曲线方程，若以S为自变量，V为因变量，可以作出双曲线，与实验测得的结果相符。,（2）稳态理论,1925年，Briggs和Haldane提出了稳态（steady state）理论，对米氏方程做了一项很重要的修正： 在 反应式中，k3值不小，后一步骤不是限速步骤。 所谓稳态是指反应进行一段时间后，系统中的酶底物复合物浓度由零逐渐增加到一定数值，然后保持不变，即处于稳态水平，此时ES的解离和分解速率之和等于ES的形成速率，,根据稳态学说推导速度方程,产生ES的速率 消耗ES的速率 稳态时 所以,根据稳态学说推导速度方程,移项得,令 ，代入上式得,将上式中的ES解出得,此ES即为稳态时的复合物浓度。,根据稳态学说推导速度方程,因为酶反应速率与ES成正比，即 所以,又因为当所有的酶都与底物结合形成复合物时，反应速率达到最大，即 ，代入上式得,（稳态法）,（快速平衡法）,两个米氏方程的区别,这两个方程的区别就在于快速平衡法推导的方程中米氏常数是Ks，而稳态法推导的米氏方程中米氏常数是Km。,Ks是ES的解离平衡常数,米氏方程的几个特点,从米氏方程中可以看出： 当S Km时， ，反应速率达到最大，并与底物浓度无关，属零级反应； 当S = Km时， ，所以，Km的意义是使反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度。,米氏方程曲线,米氏常数的意义, Km是酶的特征性常数，其单位是浓度单位。在一定的反应条件下，对于一定的底物，Km是定值。 Km可以判断酶的天然底物。有些酶可以作用于几个底物，其中Km最小的底物是天然底物。 当k3 k2时，Km = Ks，可以作为判断酶与底物亲和力的指标，Km越小，酶与底物的亲和力越大。 根据Km值，可以计算出在某一底物浓度下，反应速率是最大反应速率的百分之多少。 根据细胞内酶反应正反两方面的底物浓度，以及两方面的Km值，可以推测细胞内代谢的方向。,米氏方程S与 V / Vm 的关系,当S=10Km时，V=0.91Vm 当S=0.1Km时，V=0.091Vm 反之，可以计算出要达到一定的最大反应速率的分数，需要加多少底物。 （见P360表9-2）,Vm和k3的意义,在一定的反应条件下，Vm与酶浓度成正比。当SKm时，V = Vm = k3E0，此时对底物来说是零级反应，对酶来说是一级反应，k3是一级反应速率常数，k3表示当酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数（又称为转换数），这时的k3又可以写成 kcat，kcat 越大，说明酶的催化效率越高。,kcat /Km的意义,Kcat /Km表示酶的催化效率，Kcat /Km越大，催化效率越高。 ，其最大值极限是k1，而k1是酶与底物结合的速率常数，此常数受到底物在溶液中扩散速度的影响。,作图法求Km和Vm值 （Lineweaver-Burk双倒数作图法）,将米氏方程两边取倒数得 在一系列S下测出相应的反应速率v，以 对 作图，可得出Km和Vm值。,米氏方程的双倒数图,多底物的酶促反应动力学,（酶促反应按底物分子数的分类）,多底物反应按动力学机制分类 （序列反应）,底物的结合和产物的释放有一定的顺序： E+A+BEABEPQE+P+Q 产物不能在两种底物都结合之前释放。这类反应又可以分为两种类型。,有序反应 （ordered reaction）,其中P是B转变的产物，Q是A转变的产物。 如脱氢酶的辅酶NAD(P)+相当于A，NAD(P)H相当于Q。,随机反应 （random reaction）,如肌酸激酶催化肌酸与ATP反应生成磷酸肌酸和ADP。,乒乓反应 （ping pong reaction）,如转氨酶催化转氨反应： 氨基酸1 酮酸2 酮酸1 氨基酸2,A B P Q,三、酶的抑制作用,因酶蛋白变性而酶活力丧失称为酶的失活作用，而因为某种物质与酶结合使酶活力丧失称为酶的抑制作用，酶受抑制丧失活力时酶蛋白并没有变性。能抑制酶活力的物质称为酶的抑制剂（inhibitor）。 研究酶的抑制作用是研究酶的结构和功能、酶的催化机制，以及阐明代谢途径的基本手段，也可以为医药设计新药物和为新农药的研制提供理论依据。,抑制程度的表示方法,（1）相对活力分数（残余活力分数） （2）相对活力百分数（残余活力百分数） （3）抑制分数（被抑制而失去活力的分数） （4）抑制百分数,抑制作用的类型,1不可逆抑制作用（irreversible inhibition） 抑制剂与酶活性中心的基团以共价键结合，不能用透析、超滤、凝胶过滤等物理方法去除。 2可逆抑制作用（reversible inhibition） 抑制剂与酶活性中心的基团以非共价键结合，可以用透析、超滤、凝胶过滤等物理方法去除而使酶恢复活力。,可逆抑制作用的3种类型,（1）竞争性抑制（competitive inhibition） I 和 S 竞争与酶的活性中心结合，二者只能结合一个。竞争性抑制剂通常是底物类似物，它可以与酶结合，但不能被