黄曲霉毒素的检测及防控.ppt

黄曲霉毒素的检测及防控,analysis and control of aflatoxins,内 容,黄曲霉毒素的概述 黄曲霉毒素的国际限量要求 黄曲霉毒素的检测 黄曲霉毒素污染的预防和控制 山东局技术中心黄曲霉毒素实验室 输欧花生黄曲霉毒素实验室检测,一、黄曲霉毒素概述,黄曲霉毒素的研究历史 黄曲霉毒素的毒理作用 黄曲霉毒素的产生 黄曲霉毒素的分布 黄曲霉毒素的化学性质,研究历史,1960年, 英国10万只火鸡死亡事件揭开了人们对于黄曲霉毒素的认识与研究。 火鸡的死亡与饲料中含有较高浓度的黄曲霉毒素有关。 用这种饲料（花生粉）对动物进行急性毒理实验后，证明具有强毒性。对大白鼠进行长期的慢性中毒实验后，成功地诱发了肝癌。 对毒饲料进行提取，得到了黄曲霉毒素。 在随后的几十年中，黄曲霉毒素得到了科学界的高度重视。,黄曲霉毒素的毒理作用,黄曲霉毒素是潜在的肝脏毒素。当大剂量摄入这些毒素时可能是致命的。亚致死剂量会导致慢性中毒，而低剂量的长期接触则会致癌，特别是导致肝癌。通常，动物幼仔比成年动物更加容易遭受黄曲霉毒素的毒害。 黄曲霉毒素引起了人们对健康最强烈的关注，是因为其广泛分布于一些食物诸如花生、坚果、牛奶、玉米中，同时也是人类潜在的致癌原。,黄曲霉毒素的产生,黄曲霉毒素主要由黄曲霉和寄生曲霉等在代谢过程中产生。 黄曲霉毒素产生的条件：菌株的产毒能力、适宜的湿度（80%-90%相对湿度和基质的含水量）、温度（24-30度）、氧气（1%以上）、培养时间、机械损伤、昆虫损害等。,黄曲霉毒素的分布,黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2大多分布在农产品中，常见的有花生、玉米、棉籽、芝麻、杏仁、辣椒等。 黄曲霉毒素m1分布在牛奶及奶制品中。 在哺乳动物的肝脏与尿中发现了黄曲霉毒素p1和q1。,黄曲霉毒素的化学性质,黄曲霉毒素是结果相近的一群衍生物。化学结构式为二呋喃环和香豆素。在紫外线下，黄曲霉毒素b1、b2发兰色荧光，黄曲霉毒素g1、g2发绿色荧光。 黄曲霉毒素的分解温度为237-299度，一般加热不能破坏其毒性。 在有氧条件下，紫外线照射可去毒。 难溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，但不溶于石油醚、己烷和乙醚中。一般在中性及酸性溶液中较稳定，在强碱溶液下易分解,黄曲霉毒素 b1同肝细胞dna的鸟嘌呤碱基结合，使得控制细胞 生长的基因代码发生错误，从而使细胞生长失控，成为癌性肿瘤。,二、黄曲霉毒素的国际限量,codex,花生(未加工): 黄曲霉毒素总量 15ppb 牛奶: 黄曲霉毒素m1 0.5ppb,eu,黄曲霉毒素b1/总量 花生、坚果、干果： 2/4ppb 花生（进一步挑选等）：8/15ppb 坚果、干果（进一步挑选）：5/10ppb 谷物及加工产品：2/4ppb 各种调味品：5/10ppb,澳大利亚、新西兰,黄曲霉毒素总量： 花生：15ppb,美国,所有食品： 黄曲霉毒素总量 20ppb,黄曲霉毒素的中国限量,玉米、花生、花生油、坚果等 b1不得超过20ppb。 大米、其他食用油等b1不得超过10ppb。 其它粮食（麦类、面粉、薯干）、发酵食品（酱油、醋等）、淀粉类制品（糕点、饼干、面包等） b1不得超过5ppb。 牛奶及其制品中m1不得超过0.5ppb。,三、黄曲霉毒素的检测,黄曲霉毒素的检测，从广义上，包括：采样、制样和检测三个过程。 黄曲霉毒素的检测一直是困扰世界各国的难题。原因：不均匀分布；ppb水平,检测程序analytical procedure,采 样,样品制备/分样,分析检测,采样 sampling,目的：得到一个有代表性的样品 困难：1）分布不均匀 2）ppb水平 办法：尽量加大采样点和采样量，使货物的每个部位都有同等的机会被抽到。,均匀分布（如蛋白质） 不均匀分布（黄曲霉毒素）,所谓“ppb” 1，000，000，000中的1分子 32年中的1秒 地球至月球总距离中的40cm 22公斤沙子中的1粒 3.5车厢中的1粒玉米,检测误差 errors in analysis,集装箱,样品,小样,检测,100%总误差,88%采样误差,10%制样误差,2%检测误差,whitaker dicken，1974,针对卡车或拖车装载玉米的取样方式: 第一次取样的位点标记为 “o”. 如果需要更多的样品，应在标记为 “x”的位点再次取样,取样方式,一卡车玉米中有20ppb黄曲霉毒素的污染,样品制备 sample preparation,目的：将样品充分粉碎、均质化，为下一步检测做准备 办法：使用高效粉碎机，粉碎最终直径小于2mm 制样误差约占总误差的10%,分析检测 test,提取extraction 净化purification 分析analysis,分析程序 - 提取 使用甲醇/水或乙腈/水混合液萃取研磨样品,使用搅拌机(2-5 minutes)或震荡仪 (30-180 minutes)震荡萃取液.,样品液数量与溶剂数量存在最 佳比例。 注意所使用的有毒溶剂对健康的损害及污染,分析程序-净化,净化是指去除提取液中的杂质（如脂肪、蛋白质、色素等），以避免对黄曲霉毒素的检测造成干扰。,几种常用的净化方法,免疫亲和柱 (iac)净化 固相萃取柱（spe）净化 液-液萃取 其他,黄曲霉毒素的分析方法,快速筛选法： 荧光光度计法 elisa法 确证方法： hplc-fld法,免疫亲和柱净化-荧光光度计法,原理：紫外线照射后，黄曲霉毒素能发射特征荧光 优点： 1、操作简便、安全 2、检测限小于2ppb 缺点：有假阳性的存在,酶联免疫法,原理：利用抗原抗体反应并由酶催化底物产生颜色进行定量的分析方法 优点： 1、操作简便、成本较低 2、有些商品化的试剂盒检测限能达到1ppb 缺点：有假阳性的存在,方法的选用,经过筛选方法检测的样品，可以继续通过基准方法进一步确证黄曲霉毒素的存在，并进行更加准确的定量检测。,四、黄曲霉毒素的预防与控制,预防 prevention 采样 sampling 样品制备 sample preparation 样品提取 extraction 测试需求评价 evaluation of testing requirements 检测 testing 结果确证 result validation 文本化 documentation 供货方介入 supplier involvement 去毒 removal,五、山东局技术中心生物毒素实验室介绍,1. a professional mycotoxin laboratory. 一个专业化的官方实验室 2. a long history to detect aflatoxin. 检测黄曲霉毒素历史悠久,introduction,悠久的历史,use biology method since 1970s. use tlc method since 1980s. use hplc method since 1990s,生物毒素检测业务,& 实验室认可,stciq is accredited by china national accreditation service for conformity assessment (cnas) and operated in accordance with iso/iec 17025:2005 (e) general requirements for the competence of testing and calibration laboratories.,fapas 成绩,组织国内能力验证活动 1,时间 : 2002年 analyse: 花生酱中的黄曲霉毒素 组织者: cciblac 轮次 : 国认实函200117号 参加实验室数 : 63,组织国内能力验证活动 2,时间 : 2005 analyse: 花生酱中的黄曲霉毒素 组织者: 国家食品安全局 round: 质检食函2005082号 参加实验室数 : 15,组织国内能力验证活动 3,日期: 2005 analyse: aflatoxin analysis in peanut paste 组织者: 山东局 round: 鲁检便食字第077号 attended laboratory number : 52,组织国内能力验证活动 4,date: 2006(on going) analyse: aflatoxin analysis in peanut paste sponsor: cnas round: cans t0339 attended laboratory number : 74,组织国内能力验证活动 5,date: 2006 analyse: aflatoxin analysis in peanut paste sponsor: 山东局 round: attended laboratory number : 89,六 输欧花生黄曲霉毒素的实验室检测工作,& （黄曲霉毒素的检测流程）flow chart of aflatoxin analysis,接样 sample receive 样品登记 sample register 样品制备 sample preparation 净化 sample clean up 测定 sample hplc determination 报告 report 留样、记录 reserve samples and records,接样 (1),is it sealed ? is it clearly labelled ? is it weigh about 30kg ?,sample receive (2),样品登记,分 样,samples must be thoroughly mixed before divided into three sub-samples,样品制备 、样品均匀性测试 sample preparation,实验室样品、留存样品 sample preparation record,实验室前处理sample clean-up,仪器测定 hplc determination,如何保证检测结果的准确？ 实验室质量控制,1、样品制备过程： 定期进行样品均匀性核查 2、实验室检测过程： 日常检测采用加标回收和质控样品 加标回收 质控样品 3、每年参加国际间实验室能力验证活动,检 测 报 告 的 格 式 与 解 释,1、 方法的检出限（lod） 2、方法的检测限（loq） 3、 回收率（recovery） 4、 不确定度（ uncertainty）,报告中的检出限、检测限,针对gb/t 18979-2003方法 检出限是0.3ppb，检测限是1.0ppb 报告的三种情况： 未检出： 低于检出限 1.0 ppb ：检出了，但不能准确定量 实际值： 能准确定量,回 收 率,检测结果与真实值 recovery（100%）= 检测结果 / 真实值 如何得到真实值？ 1）购买有证样品（质控样品） 2）空白添加已知浓度的标样 （质控样品） 将待测样品与质控样品同批检测，计算回收率。,报告中的回收率校准,样品1与质控样品（样品a）同批检测，样品a的实际值为2.0ppb。 结果：样品1的检测结果为3.0ppb，样品a的检测结果为1.8ppb。 回收率计算：1.8/2