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第二章,核酸的化学,本章主要内容 核苷酸 DNA RNA 核酸的性质,认识核酸在生命科学上的重要性 弄清碱基、核苷、核苷酸和核酸分子结构上的关系 掌握核酸的化学本质及DNA和RNA在组分、结构和功能上的差异 认识核酸的结构与其性质与功能之间的关系。,学习要求,1869年 F.Miescher首先从伤员绷带的脓细胞中分离得到称为“核素”的核酸 1944年 O.N.Avery通过转化实验证实DNA是主要的遗传物质 1953年 J. D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA双螺旋结构模型 1958年 Crick提出遗传信息传递的中心法则 1970年,建立DNA重组技术 1980年后,分子生物学、分子遗传学等学科突飞猛进发展，提出并完成HGP.,核酸化学的发展过程,一、概述 概念,核酸(nucleic acid)是由碱基（嘌呤和嘧啶）、戊糖和磷酸组成的高分子物质，是生物体的基本组成。 种类： DNA （脱氧核糖核酸） RNA（核糖核酸）,“四核苷酸假说”：核酸由四种核苷酸组成的单体构成的，缺乏结构方面的多样性,不大可能有重要的生理功能。 1944年，Avery等人的肺炎双球菌转化实验证实核酸是生命遗传的基础物质。 1952年，Hershey和Chase的T2噬菌体侵染实验彻底证明遗传物质是核酸，而不是蛋白质。,1928年，英国 S型肺炎球菌：有荚膜，菌落表面光滑 R型肺炎球菌：没有荚膜，菌落表面粗糙,著名的肺炎球菌实验,结果说明？,结果说明：加热杀死的S型肺炎球菌中一定有某种特殊的生物分子或遗传物质，可以使无害的R型肺炎球菌转化为有害的S型肺炎球菌 这种生物分子或遗传物质是什么呢？,著名的肺炎球菌实验,纽约洛克非勒研究所 Avery 从加热杀死的S型肺炎球菌将蛋白质、核酸、多糖、脂类分离出来，分别加入到无害的R型肺炎球菌中， 结果发现，惟独只有核酸可以使无害的R型肺炎球菌转化为有害的S型肺炎球菌。 1944年 结论：DNA是生命的遗传物质,噬菌体侵染实验,分布：,DNA：主要在细胞核中，是染色体的主 要成分。此外在线粒体、叶绿体. RNA：主要在细胞质中，此外在线粒体、细胞核核仁；,二、核酸的组成成分,核酸是一种线形多聚核苷酸(polynucleotide), 其基本结构单位是核苷酸(nucleotide)。,核苷酸的基 本结构,（一）核酸中的戊糖,D-核糖（D-ribose） D-脱氧核糖 （D-deoxyribose） 核酸据此分类： 脱氧核糖DNA； 核糖RNA； 核酸中的戊糖均为 -D-型,核苷酸,从两类核酸的水解产物可看到它们组成的差别?,（二）碱基,核酸中的碱基分两类： 1、嘧啶碱(pyrimidine)：是嘧啶的衍生物。,嘧啶,1,2,3,4,5,6,H,胞嘧啶 Cytosine,（C）,尿嘧啶 uracil,（U）,H,H,胸腺嘧啶 thymine,（T）,2、嘌呤碱(purine)：由嘌呤衍生而来。,1,2,3,4,5,6,7,8,9,嘌呤,腺嘌呤 adenine,（A）,鸟嘌呤 guanine,（G）,3、稀有碱基：,一些修饰碱基，因含量甚少而称之。 大多为甲基化碱基，多在tRNA中。,（三）核苷： (nucleoside),核苷：戊糖与碱基缩合而成，并以糖苷键相连接。 糖苷键： 二者的连接是C-N键，称N-糖苷键。,腺 苷,尿苷,OH,假尿苷（）,核苷的表示：,核苷：A、G、 C 、U 脱氧核苷：dA,dG,dC,dT 修饰核苷： 如5-甲基脱氧胞嘧啶：m5dC。,脱氧核糖核酸和核糖核酸异同的对比,（四）核苷酸(nucleotide，nt),1、种类： 1）按酯化位点：可在核糖的2- , 3-, 5-； 2）按核糖类型： 核苷酸、 脱氧核苷酸,核苷中戊糖的羟基被磷酸酯化，即为核苷酸。,2、结构：,3、表示：,与一个磷酸结合MP：(d)AMP、(d)GMP、(d)CMP、(d)TMP、UMP 与二个磷酸结合DP：如：ADP 与三个磷酸结合TP： 如：ATP,核苷酸,4、特殊核苷酸：,环核苷酸： 核糖3-, 5- 成环。 cAMP、 cGMP 功能： 第二信使，激素、一些药物、神经递质通过其发挥生理作用。,核苷酸,核苷酸衍生物,环化磷酸化,cAMP,cGMP,核苷酸衍生物,5- IMP 5- 肌苷酸 (5- 次黄嘌呤核苷酸) 5- GMP,（五）核苷酸的连接方式,1、 3-, 5磷酸二酯键将核苷酸连接成核酸大分子。,一、核苷酸,2、核酸的一级结构：,多核苷酸链中各核苷酸残基的排列顺序。,3,5,1,P,P,P,OH,A,T,G,pGpTpAOH,pG-T-A,pGTA,1）一级结构表示方法如上：,2）读向：,碱基序列从左到右表示5 3，由3-, 5磷酸二酯键连接。 若两链反向平行，则需注明每条链的走向。如： 5A-T-G-C-C-T-G-A 3 3 T-A-C-G-G-A-C-T 5,核苷酸,三、DNA,（一）DNA 的一级结构： 由数量庞大的4种脱氧核苷酸通过3-, 5磷酸二酯键连接成的直线形或环形多聚体。,（二）DNA的双螺旋二级结构,1、双螺旋结构模型建立的依据： 1） chargaff对DNA碱基组成的定量分析,提出碱基配对原则：A=T， GC 2）根据对DNA纤维和晶体的x-衍射分析。 3）电位滴定证明。 A=T， GC,DNA,双螺旋中的碱基对（base pair,bp),2.双螺旋结构的特点:(Watson-Crick模型）,1）形成： 两条链反向平行； DNA一条链为另一条链互补链 右手螺旋。,DNA,2）结构：,A、核糖-磷酸以3-, 5磷酸二酯键连接成骨架； 碱基在内； A=T， GC B、大沟、小沟。,DNA,3）尺寸：,DNA,A、直径：2nm ； B、碱基距离：0.34nm； C、一周10个核苷酸； D、螺距：3.4nm 。,4）双螺旋的稳定性：,A、依靠碱基堆积力 B、氢键 C、离子键,3、二级结构的构象类型：,DNA,B-DNA,A-DNA,Z-DNA,B-DNA与A-DNA,几种DNA钠盐的特点 ：,B-DNA：生理状态下多为此种；92%相对湿度 A-DNA：右手螺旋；75%相对湿度；生理状态 下多见dsRNA、DNA-RNA Z-DNA：人工合成、左手螺旋；嘧啶、嘌呤交 替；有m5dC ；与基因表达调控有关； 此外，还发现有C、D、E等型。,(三）DNA的三级结构,DNA双螺旋进一步扭曲即成 三级结构。 天然DNA有双链DNA（dsDNA）， 有的病毒为单链DNA（ssDNA） 在dsDNA中： 线形分子（大多数） 环状分子（dcDNA）：质粒、,DNA,1、超螺旋结构,特点： 可将长链压缩 在一较小体内； 密度大； 凝胶电泳中移 动速度快。,DNA,回文结构中的单链可形成发夹结构,特殊DNA的结构,上页 下页 章首 节首,双链回文结构可形成十字架结构,特殊DNA的结构,上页 下页 章首 节首,DNA的其他结构,DNA三股螺旋概念是在1957年提出来的，当时有人发现，人工合成的一条右手螺旋多聚物(A)n与另两条右手螺旋多聚物(T)n形成三股螺旋结构，这是分子间的三股螺旋。此后有人研究证明，聚dA链首先与一条聚dT链互补形成双螺旋，然后，在高盐条件下， 另一条dT链再同双螺旋形成三股螺旋结构。 双螺旋结构通过Watson-Crick氢键稳定而三股螺旋是通过 Hoogsteen氢键稳定。,DNA的三股螺旋结构,2、核小体中的 扭曲方式,在真核细胞染色质中， DNA双螺旋分子盘绕 在组蛋白上形成核小体。 许多核小体由DNA 连成念珠状结构，再盘 绕压缩成高层次的结构 染色体。,DNA,真核生物：DNA和蛋白质组装成染色体，染色体的基本单位是核小体。,核小体进一步旋转折叠形成棒状染色体，将近1 m长的DNA分子容纳于直径只有数微米的细胞核中。,1、DNA是遗传信息的载体,半保留复制 保证了亲代 性状传到子 代，保证了 亲代与子代 的相似性。,DNA,（四）DNA的功能,2、DNA是变异的物质基础,变异是生物进化的基础。变异的发生： 1）DNA复制时出错； 2）理化因素等引起碱基变化或缺失，使DNA碱基序列改变，从而发生性状变异。,DNA,四、RNA,（一）RNA的结构 组成：4种核苷酸，有稀有碱基； 连接：同DNA 形成：一般以DNA为模板合成，有例外。 结构：单链线形分子，局部区域有双螺旋。,（二）RNA的类型,三种： 信使RNA（messenger RNA,mRNA) 核糖体RNA (ribosomel RNA,rRNA) 转运RNA (transfer RNA,tRNA),RNA,三种RNA的功能,mRNA是遗传信息的携带者。在细胞核中转录DNA上的遗传信息，再进入细胞质，蛋白质合成的模板。 tRNA起识别密码子和携带相应氨基酸的作用。 rRNA和蛋白质共同组成的复合体就是核糖体，核糖体是蛋白质合成的场所。,1、tRNA,约占全部RNA的 15%；由70-90个核 苷酸组成许多种类； 沉降系数4S。,RNA,1）tRNA结构：,一级结构多已清楚， 含较多稀有碱基； 二级结构为三叶草 有：aa臂、 二氢嘧啶环、 反密码环、 可变环、 T 环,RNA,主要特征： 1.四臂四环； 2.氨基酸臂3端有CCAOH的共有结构； 3.D环上有二氢尿嘧啶（D）； 4.反密码环上的反密码子与mRNA相互作用； 5.可变环上的核苷酸数目可以变动； 6.TC环含有T和；7.含有修饰碱基和不变核苷酸。,tRNA 三级结构 为倒L型,A、在pr合成中转运aa； B、在pr合成的起始、DNA反转录合成及其它代谢调节中起作用。,2）tRNA功能：,2、mRNA和hnRNA,1）合成： 以DNA为模板(核内) 合成 hnRNA（含内含子和外显子） 加工 成熟的mRNA 入细胞质 蛋白质合成,RNA,合成mRNA,切除内含子,2) mRNA结构特点：,3末端有polyA结构：与mRNA从核入质有关。 5末端有帽子结构：G被甲基化，此可能与pro合成的起始有关。,3) 功能：是蛋白质合成的模板,3、rRNA,1)占RNA总量的80%，是构成核糖体的骨架。 2)核糖体功能： pr合成的部位. 3）结构：分大、小亚基 一、二级结构多已确定，但功能不清。,RNA,原核细胞：70S核糖体； 真核细胞：80S核糖体；,核糖体RNA自我剪切,1983年在四 膜虫中发现 RNA有催化功能,4、RNA的功能,1）在DNA复制、转录、翻译中起重要调控 作用； 2）有催化作用； 3）可作为遗传物质（如逆转录病毒）。,RNA,五、核酸的性质,（一）一般的理化性质,为两性电解质，通常表现为酸性。 DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末，微溶于水，不溶于一般的有机溶剂。 DNA溶液的粘度极高，而RNA溶液要小得多。 核酸在离心力的作用下，可以从溶液中沉降下来，其沉降速度与核酸的大小和密度有关。,核酸的溶解性质,DNA和RNA都微溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。 DNP溶于高浓度盐溶液中，而RNP溶于低浓度盐溶液。，利用这一性质可分离DNA和RNA。,0.14摩尔法:分离DNA蛋白(DNP)和RNA(RNP)蛋白(RNP)的方法 DNA蛋白:在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低. RNA蛋白:在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度较大.,水解性：可被酸、碱或酶水解，DNA比RNA对稀碱稳定。,核酸分子中的磷酸二酯键可在酸、碱性和酶条件下水解切断,结果是多核苷酸链被打断,核酸被降解. 酸解 酸可以使DNA和RNA降解，酸对核酸的作用因酸的浓度、温度和作用时间的不同而不同。,碱解,DNA和RNA对碱的耐受程度有很大差别。例如，在0.1 mol/L NaOH溶液中，RNA几乎可以完全水解，生成2-或3-磷酸核苷；DNA在同样条件下则不受影响。这种水解性能上的差别，与RNA核糖基上2-OH的参与作用有很大的关系。在RNA水解时，2-OH首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。 DNA在稀碱的作用下，只会发生变性，不会发生磷酸二酯键的水解。,酶水解,1、根据底物分类 DNase、RNase； 单链核酸酶、双链核酸酶、杂合双链核酸酶 2、根据催化部位分类：外切核酸酶和内切核酸酶 外切酶：5端3端或3端5端核酸外切酶。 内切酶：限制性核酸内切酶和非限制性核酸内切酶。 限制性核酸内切酶(restriction endonucleases)：能够识别DNA分子的特定核苷酸序列，并在识别位点或其周围断开DNA双链的一类核酸酶,DNA限制性内切酶,细菌的限制-修饰系统：限制性核酸内切酶（限制酶）特异性强，可在DNA特异位点切开；,细菌碱基修饰：,概念：在DNA特定短碱基序列上产生某专一性修饰，使得内切酶无法识别而不能断裂。 如：修饰甲基化酶。,参与DNA修复及RNA合成后的剪接等重要基因复制和基因表达过程 负责清除多余的、结构和功能异常的核酸，同时也可以清除侵入细胞的外源性核酸 在消化液中降解食物中的核酸以利吸收 体外重组DNA技术中的重要工具酶,生物体内的核酸酶负责细胞内外催化核酸的降解,颜色反应：,1）核糖与浓盐酸和苔黑酚(甲基间苯二酚)共热呈 绿色，在670nm处可测RNA； 2）2-脱氧核糖与酸和二苯胺共热呈蓝紫色， 在595nm处可测DNA。 二种反应可作定性试验，定量试验灵敏度低、准确性差，但快、简便。,核酸的性质,1、一个单链DNA和一个单链RNA分子量相同，试述可以用几种方法将它们区分开？,2.转食品基因安全吗？,转基因有两派 反对派：反对派的道理在于转基因抗病抗虫的功能来自于毒蛋白基因，虫吃了是要死的，人吃了怎么办？ 赞成派：昆虫的死亡是因为气孔闭塞了，但这跟人的消化道完全是两码事。” 中间派：,人民不是小白鼠,（二）紫外吸收性质,碱基具共轭双键强烈吸收260-290nm波段 紫外光，最大吸收峰在260nm附近。 应用： 1、不同核苷酸有不同吸收特性，可用紫外分光光度计进行定性、定量测定。 1 OD相当于：50g/ml DNA 40g/ml RNA,核酸的性质,2、确定所提取的核酸是否纯品。 1）DNA： OD260/OD280 1.8 纯品 2）RNA： OD260/OD280 2.0 纯品 在纯化DNA 时,通常用A260/A280=1.8- 2.0 作为纯度标准,若大于此值,表示有RNA 污染;若小于此值,则有pro 或酚污染.,核酸的性质,（三）核酸结构的稳定性,1、碱基堆积力：双螺旋内部碱基形成的疏水区； 2、碱基间的氢键： 3、磷酸基与介质中阳离子形成的离子键,核酸的性质,（四）核酸的变性,1、变性的概念 1）现象：双螺旋DNA和具双螺旋区的RNA氢键 断裂，空间结构被破坏，形成单链无规 则线团状的过程。,核酸的性质,2）结果： A、增色效应： 260nm紫外吸收增加； B、粘度下降； C、生物学性能部分或全部丧失。 3）引起变性的因素： 温度、pH、尿素、甲醛等。,核酸的性质,增色效应,DNA变性后，由于双螺旋解体，藏于螺旋内部的碱基暴露出来，使DNA的A260值升高，这种现象称为增色效应。,变性DNA,天然DNA,2、热变性与Tm,Tm：在热变性中，紫外吸收增加量达最大增量一半的温度，称该DNA的熔解温度（melting temperature,Tm); 又称热解链温度。 (G+C)%=(Tm -69.3)*2.44,核酸的性质,3、影响Tm的因素：,1）G-C含量：Tm与G-C含量成正比。 2）介质中的离子强度：离子强度低，Tm低，在纯水中, DNA 在室温下即可变性。 3）溶液的pH . 4) 变性剂,核酸的性质,（五）核酸的复性,概念：变性DNA在适当条件下（缓慢降温），可 使两条彼此分开的链重新缔合成双螺旋结 构的过程。 复性后，许多物化性质可得到恢复， 生物学活性部分恢复。 影响因素：温度、DNA片段大小、DNA浓度、碱基 重复序列多少、离子浓度。,核酸的性质,DNA变性与复性,减色效应,当变性的DNA经复性又重新形成双螺旋结构时，其溶液的A260值减小，最多可减小至变性前的A260值，这种现象称为减色效应。,六、分子生物学技术,（一）分子杂交与探针技术 1、概念： 1）分子杂交（hybrization): 在退火条件下，不同来源的DNA互补区形成氢键，或DNA单链和RNA链的互补区形成DNA-RNA杂合双链的过程。 DNA-DNA： DNA-RNA:,分子生物学技术,核酸的杂交,2)探针（probe),用放射性同位素或荧光标记的DNA或RNA片段. 确诊病人细胞中提取的DNA； 病毒DNA ； 肿瘤组织提取的DNA。,分子生物学技术,3） Southern印迹法,分子生物学技术,用于检测DNA 方法：如图,Northern 印迹法：用于检测RNA Northern印迹法：将电泳分离后的RNA吸印到纤维素膜上再进行分子杂交。,4）聚合酶链式反应（polymeerase chain reaction, PCR),聚合酶链式反应（PCR）,每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍,30轮循环可获得 230（1.07109)个基因片段,应用：,广泛用于克隆、测序、产生特异突变、医学诊断和法医.,核酸分子的核苷酸序列分析是以纯品核酸为材料，经水解，测定核苷酸组成及比例。先以外切酶确定5-或3-末端核苷酸，再以内切酶将核酸链分为若干寡核苷酸段，分段测定核苷酸组成、比例和序列。最后将核苷酸序列的各寡核苷酸重叠，确定整个核酸分子的核苷酸序列。,(五) 核酸序列分析,核苷酸序列分析中断裂磷酸二酯键用酶,DNA酶法测序,1977年sanger发明末端终止法测定DNA序列。 根据sanger测序法，现在已经有各种DNA自动测序仪，DNA测序速度大大加快HGP得以提前完成,DNA酶法测序,DNA酶法测序,平行进行四组反应，每组反应均使用相同的模板，相同的引物以及四种脱氧核苷酸；并在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，使其随机地接入DNA链中，使链合成终止，产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。这四组DNA链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测DNA的核苷酸序列,如下图所示：,DNA酶法测序,DNA酶法测序,本章总结,核苷：核苷酸：cAMP：磷酸二脂键：脱氧核糖核酸（DNA）： 核糖核酸（RNA）： 核糖体核糖核酸（rRNA）：信使核糖核酸(mRNA)：转移核糖核酸（tRNA）：碱基对：查盖夫定律（Chargaffs rules）： 大沟和小沟： DNA超螺旋： DNA变性：退火：熔解温度（Tm）：增色效应：减色效应.,核酸的化学结构：碱基、核苷、核苷酸。 DNA的结构：DNA的一级结构、二级结构，RNA的结构：RNA的类型和结构特点，tRNA 、mRNA、 rRNA的结构和