翻译及翻译后加工.ppt

蛋白质的生物合成 （翻译） Protein Biosynthesis or Translation,DNA,RNA,蛋白质多肽链,遗传信息的传递过程,蛋白质合成体系 Protein Biosynthesis System,.三种RNA: mRNA（messenger RNA, 信使RNA） rRNA（ribosomal RNA, 核蛋白体RNA） tRNA（transfer RNA, 转移RNA）,20种氨基酸(amino acid)作为原料 酶及众多蛋白因子，如IF、eIF, ATP、GTP、无机离子,一.生物合成的模板mRNA,（一）原核生物mRNA的特点,原核生物mRNA的起始密码AUG 上游7个核苷酸以外有一段 5-UAAGGAGG- 3 的保守序列 称为S-D(Shine-Dalgarno Sequence) 该序列是核糖体识别结合的位点,1. S-D(Shine-Dalgarno )序列,2.多顺反子(polycistron),顺反子(cistron),遗传学将编码一个多肽的mRNA 上的遗传单位称为顺反子,乳糖操纵子模型,多顺反子,乳糖操纵子结构,多顺反子,（二）真核生物mRNA的特点,起始密码子常处于CCACCAUGG 序列中，这段保守序列的存在能增加 翻译起始的效率，这段序列称为 Kozark序列(Marilyn Kozark) ., Kozark序列 (Marilyn Kozark),原核生物mRNA,真核生物mRNA,PPP,mG -,5,3,蛋白质,AAA,真核生物mRNA的特点 （单顺反子）,二、蛋白质生物合成的场所,场所：核糖体（ribosome),结构: Mg2+,蛋白质，rRNA,（一） 核蛋白体（rRNA）,蛋白质蛋白质， rRNA蛋白质组成两个亚单位，称之为大小亚基,核糖体的沉降系数(S)和亚单位,不同细胞核蛋白体的组成,原核生物各组分的功能:,1.大亚基rRNA具有肽酰基转 移酶活性,催化肽键的合成.,2. 小亚基具有mRNA上S-D互补的序列,是识别结合mRNA 的位点.,3.核糖体大亚基5SrRNA具有 两个保守序列,其中一个与tRNA的 T互补识别序列,另一个与23SrRNA互补 识别序列,稳定核糖体结构.,(二)核糖体蛋白作用,1.维系核糖体稳定结构的骨架 2.保护rRNA防止被核酸酶降解. 3.与rRNA构成功能活性区域. 如: 肽酰基转移酶活性 蛋白因子结合位点 P、A、E氨基酰 tRNA结合位点。,mRNA结合位点,核蛋白体与起始fmettRNAfmet的结合,三、蛋白质生物合成的机制,（一）合成元件 tRNA、 rRNA和蛋白因子,tRNA,tRNA种类：30种,同工tRNA：指携带不同的密码子，但识别 相同的氨基酸的一组tRNA。,2.tRNA与氨基酸的活化：,tRNA的三级结构示意图,核塘体活性结合位点,（1）氨基酰-tRNA合成酶 (aminoacyl-tRNA synthetase),2.氨基酸的活化,活化反应：,活化反应:形成酯键,.氨基酰-tRNA合成酶对底物氨基酸和tRNA都 有高度特异性。通过其活性部位实现的。 .氨基酰-tRNA合成酶具有校正活性，将错配 的进行校正。,氨基酰-tRNA合成酶的特点,（2）活化过程：,第一步反应,氨基酸 ATP-E 氨基酰-AMP-E AMP PPi,（3）活化氨基酸的表示方法：,氨基酰-tRNA的表示方法： Ala-tRNAAla Ser-tRNASer Met-tRNAMet,4蛋白因子,3rRNA,（）起始因子： 原核生物IF ：IF，IF,IF 真核生物eIF： eIFeIF ,eIF 帽结合蛋白（CBP/ eIF ) eIF,（）延长因子EF： 原核生物： EF-T， EF-G 真核生物：EF-EF-,（）释放因子 RF： 原核生物：RF-1， RF-2 ,RF-3， 真核生物： eRF,第一节 遗传密码 (genetic code),一.遗传密码及密码的破译,(一) 遗传密码(genetic code) : 指编码蛋白质氨基酸序列基因中的核苷酸体系.,从mRNA 5端起始密码子AUG开始， 每三个核苷酸为一组决定肽链中的一种氨 基酸 ，称为三联体密码。,三联体密码 (termination corden):, 起始密码（initiation coden ):第一个AUG AUG 意义：编码甲硫氨酸， 原核生物为甲酰化甲硫氨酸,（二）特殊密码： (special coden),UAA、 UAG 、 UGA （赭石） （琥珀） （乳白石）,终止密码（terminatiom coden）,（三）密码总数： 61个编码20种氨基酸,（四）阅读方向： 5 3 新生肽链方向 从N C,二、遗传密码的特性,（一）连续性(commaless),编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读，密码间既无间断也无交叉。,mRNA简图,每三个一组连续阅读,(二).简并性 (degeneracy),遗传密码中，除色氨酸和甲硫氨酸仅有一个密码子外，其余氨基酸有一个以上密码子。,简并性(degeneracy),目 录,两种简并性,第一和第二位碱基简并性,第三位碱基简并性（最常见）,异亮氨酸密码子,精氨酸密码子,密码子家族（coden family)： 编码相同氨基酸 的密码子。,例如：GUU GUC GUA GUG 编码缬氨酸,同义密码子：密码子家族成员之间互称同义密 码子。,（三）摆动性 (wobble),转运氨基酸的tRNA的反密码需要通过碱基互补与mRNA上的遗传密码反向配对结合，但反密码第一位与密码子的第三位不严格遵守常见的碱基配对规律，称为摆动配对。,活化的氨基酸与与密码子结合,U A U,摆动配对,密码子、反密码子配对的摆动现象,结果：一种tRNA能与多个一二位相同的三联体密码配对（简并密码子）,（四）通用性(universality),蛋白质生物合成的整套密码，从原核生物到人类都通用,又称通用遗传密码。 已发现少数例外，如动物细胞的线粒体、植物细胞的叶绿体。 密码的通用性进一步证明各种生物进化自同一祖先。,遗传密码的偏爱性 （bias or preference),多数氨基酸有一个以上的密码子但 这些密码子使用的频率各不相同，称 之遗传密码的偏爱性。,密码子使用的频率与细胞内相应的 tRNA含量有关,线粒体密码 （mitochondrial coden),AUA AUG AUC AUU=起始Met AUA AUG=链内部Met密码子 UGA=Trp UAA/UAG=GLn AGA/AGG=stop coden,三、阅读框架 （reading frame),指mRNA中一段含有翻译密码的碱基 序列,密码阅读从5 3 ，且以三个核苷酸为一组连续阅读,阅读框架可能存在的形式,核糖体选择正确的开放框架,封闭,指mRNA中从5端起始密码子AUG开 始到3端终止密码子之间正确可读序 列.,开放阅读框架 （open reading frame),（二）合成过程 起始、延长、终止,核糖体读码方向:53,肽链合成方向:N C,1.起始：,指mRNA和起始氨基酰-tRNA分别与核蛋 白体结合而形成翻译起始复合物.,需起始因子（initiation factor,IF)参与, 并消耗能量GTP(1个）,原核生物翻译起始复合物(30S)的形成,核蛋白体大小亚基分离； mRNA在小亚基上定位结合； 起始fMet-tRNAiMet的结合； 核蛋白体大亚基结合。,起始氨基酸的进位消耗能量GTP（IF-2分解）,原核生物合成起始,IF-1,核蛋白体大小亚基分离,目 录,IF1促进大小亚基分离,mRNA在小亚基定位结合,IF-3促进mRNA在小亚基定位结合,(1). mRNA位于起始密码上游8-13核苷酸部位, 存在4-9个核苷酸保守序UAAGGAGG(S-D) （2）原核生物小亚基的3端存在与之互补序列 AUUCCUCC反向互补配对,mRNA定位基础：,S-D序列,RNA-RNA识别 RNA-蛋白质识别,IF-1,起始氨基酰tRNA( fMet-tRNAimet )结合到小亚基,目 录,反密码子识别P位密码子,使起始氨基酰tRNA( fMet-tRNAimet )结合到小亚基就位.,IF-3,IF-1,目 录,反密码子识别P位密码子,使起始氨基酰tRNA( fMet-tRNAimet )结合到小亚基就位.,IF-3,IF-1,IF-2,GTP,GDP,Pi,4. 核蛋白体大亚基结合，起始复合物形成,目 录,大亚基结合，水解GTP消耗能量,释放起始因子,IF-3,IF-1,目 录,（二）真核生物翻译起始复合物形成,4.核蛋白体大亚基结合。消耗GTP,释放各因子.,1.核蛋白体大小亚基分离；,2.起始氨基酰-tRNA与小亚基P位结合；,3. mRNA在核蛋白体小亚基准确就位； ,真核生物翻译起始复合物形成过程,二、肽链合成延长,概 述 肽链合成：指根据mRNA密码序列的指导，按 次 序添加氨基酸从N端向C端延伸肽 链到合成终止的过程。,肽链延长在核蛋白体上连续性循环式进行，每次循环增加一个氨基酸，包括以下三步：,核蛋白体循环 (ribosomal cycle)：,进位(entrance) 成肽(peptide bondformation) 转位(translocation,.延长因子(elongation factor, EF),延伸过程所需蛋白因子称为延长因子 原核生物：EF-T (EF-Tu, EF-Ts); EF-G,肽链合成的延长因子,又称注册(registration),1.进位,指根据mRNA下一组遗传密码指导，使相应氨基酰-tRNA进入核蛋白体A位。,目 录,合成过程,延长因子EF-T催化进位（原核生物）,目 录,Tu,Ts,GTP,GDP,Tu,Ts,GTP,目 录,2.成肽,A位成肽,A位,N端,3.转位,延长因子EF-G有转位酶( translocase )活性，可结合并水解1分子GTP，促进核蛋白体向mRNA的3侧移动 。,EF-G转位酶活性，消耗1GTP,fMet,fMet,目 录,真核生物肽链合成的延长过程与原核基本相似，但有不同的反应体系和延长因子。 另外，真核细胞核蛋白体没有E位，转位时卸载的tRNA直接从P位脱落。,（三）真核生物延长过程,三、肽链合成的终止,当mRNA上终止密码出现后，多肽链合成停止，肽链从肽酰-tRNA中释出，mRNA、核蛋白体等分离，这些过程称为肽链合成终止。,需相应的蛋白因子(释放因子)参与,释放因子 (release factor, RF) 种类:,原核生物释放因子：RF-1，RF-2 RF-3 真核生物释放因子：eRF,1.识别终止密码，如RF-1特异识别UAA、UAG；而RF-2可识别UAA、UGA。 需能量GTP, RF-3 GTPase 2.诱导转肽酶改变为酯酶活性, 使肽链从 核蛋白体上释放。,释放因子的功能,RF,目 录,多聚核蛋白体(polysome),目 录,蛋白质合成过程中一条mRNA上附着多个核蛋白体形成多聚核蛋白体.,电镜下的多聚核蛋白体现象,目 录,多聚核蛋白体产生,四.蛋白质生物合成的调节,（一）阅读框架的漂移、重叠和5AUG 的作用,1.基因重叠调节： 同一DNA序列以不同的框架阅读方式编码不同种类的蛋白质,病毒基因组中重叠基因,基因重叠,A蛋白质,B蛋白质,2. 5-AUG的作用,起始密码AUG上游的非编码区也有一个或数个AUG称5 AUG,。, 从非编码区第一个5 AUG开始翻译很快就会遇到终止密码子,翻译的产物为无活性的短肽,减少正常AUG的翻译启动作用,从而抑制正常翻译的频率.对翻译起始的竞争.,正常翻译,5 AUG竞争正常起始密码翻译,（二）翻译错误校正,.tRNA与密码子反向互补配对，以 上是遗传信息正确解读的保障,.氨基酰-tRNA合成酶对氨基酸与 tRNA特异选择性,（三）5帽和polyA尾,2.polyA位点的数目，有或无对形成不同类型的翻译产物具有重要的调节意义,5帽和polyA尾具有保护mRNA维持 其稳定, 保证翻译过程的稳定.,降钙素基因,polyA的调节,（四）蛋白合成阻断剂,.抗生素(antibiotics)类阻断剂 是微生物产生的能够杀灭或抑制细菌的一类药物。,抗生素类,抗生素抑制蛋白质生物合成的原理,四环素族抑制氨基酰入位,目 录,与酪氨酰-tRNA相似,抗生素类,嘌呤霉素作用示意图,与氨基酰 tRNA相似 核糖体错认为A位是活化的氨基酸,抗代谢药,抗肿瘤化疗的药物: 阻断真核细胞蛋白质的生物合成.故称为抗代谢药.,抗肿瘤化疗的药物产生耐药的原因:编码人的多重耐药性基因(multiple drug resistant MDR)表达的结果,其他干扰蛋白质生物合成的物质,毒素(toxin) 干扰素(interferon),白喉毒素(diphtheria toxin)的作用机理,白喉毒素,+,+,ADP糖基化修饰,（二）干扰素：真核细胞感染病毒后能分泌 一类有抗病毒作用的蛋白质,干扰素的分类：,白细胞INF- 成纤维细胞-INF- 淋巴细胞-INF-,2.干扰素的作用机理,(2). 干扰素诱导病毒RNA降解,核酸内切酶,第三节.蛋白质的加工和修饰,肽链一级结构的修饰 高级结构修饰,蛋白质的修饰主要包括,（一）一级结构的修饰,一.蛋白质翻译后的加工修饰 (化学编辑),1.个别氨基酸的化学修饰如;羟基化, 磷酸化(丝氨酸,苏氨酸),2.结合蛋白质进行糖基化,脂酰 化及辅基的连结.,(二).高级结构的修饰 亚基的聚合,（三）蛋白质的糖基化修饰,1.实质: 一种或多种糖以共价键连接到肽链上的蛋白质。,2.场所: 内质网和高尔基体。,3.连接方式:,N-连接：,O-连接：,目 录,糖上羟基参与共价键的形成,(1)N-连接糖蛋白,定义 糖蛋白的糖链与蛋白部分的Asn-X-Ser序列的天氡酰胺氮以共价键连接称N-连接糖蛋白。,糖基化位点 N-连接糖蛋白中Asn-X-Ser/Thr三个氨基酸残基的序列子称为糖基化位点。,(2).O-连接糖蛋白,定义 糖蛋白糖链与蛋白部分的丝/苏氨酸残基的羟基相连，称为O-连接糖蛋白。,1. 对新生肽链的影响 促进肽链的折叠;维持蛋白质的正确的空间构象；影响亚基聚合; 是细胞运输和分拣的信号。,2. 保护糖蛋白不受蛋白酶的水解，延长其半 衰期。,3. 参与分子的识别作用,4.糖基化修饰作用,脱甲酰基酶,氨基肽酶切除N端的fMet或 Met.,二.肽链N端的的切除,三 .前体的加工,最初分泌是无活性的酶原形式,经肽段的切除转变有活性的蛋白质.,四.剪切和剪接,(一).剪切 已合成的多肽链经翻译后加工切割后生成多种不同活性的蛋白质或多肽.,鸦片促黑皮质素原(POMC)的水解修饰,促黑素,脂解释放激素,(二).剪接,蛋白质前体经多肽的剪辑,剪除某些氨基酸片段,再以一定的顺序连接起来最终成为成熟有活性的蛋白质过程. 被剪接的无活性的氨基酸序列成为蛋白质的内含子,它是由转座子编码的.也是翻译后的调节形式之一.,第四节 蛋白质的折叠,一蛋白质的正确折叠是其行使功能的基础,与蛋白质折叠相关的分子： 分子伴侣(molecular chaperon) 二硫键异构酶(disulfide isomerase, PDI) 谷胱甘肽 肽脯酰异构酶(peptide prolyl cis-trans isomerase, PPI),（一）分子伴侣 （chaperon),分子伴侣是细胞一类保守蛋白质，能识别肽链的非天然构象，通过与疏水肽段结合和释放作用（消耗ATP),消除蛋白质不正确的叠折，促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠。,分子伴侣分类,热休克蛋白,伴侣素,热休克蛋白 (heat shock protein, HSP),常见hsp70 功能:结合尚未离开核糖体的新生肽链或正 在穿膜的肽链,防止肽链疏水段错误聚 集,有利于 肽链的正确折叠.,2. 伴侣素(chaperonins) Ecoil 包括GroEL和GroES (真核细胞同源物HSP60, HSP10)家族，作用为非自发折叠的蛋白质创造折叠的微环境,Hsp60:具有桶状结构,伴侣素GroEL/GroES系统促进蛋白质折叠过程,hsp60,hsp60,hsp60,（二）蛋白二硫键形成,二硫键形成异构酶 谷胱甘肽,二硫键异构酶,部位:内质网 二硫键异构酶在内质网腔活性很高,多肽链内或肽链之间二硫键的正确形成对稳主要在细胞内质网进行。,功能: 在肽链中催化错配二硫键断裂并形成正确二硫键连接，最终使蛋白质形成热力学最稳定的天然构象。,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。,目 录,谷胱甘肽 链内二硫键形成起着重要作用,G-SH:还原性谷胱甘肽 G-s-s-G:氧化性谷胱甘肽,G-SH,链内二硫键形成机制,（三）.肽-脯氨酰顺反异构酶,多肽链中肽酰-脯氨酸间形成的肽键有顺反两种异构体，空间构象明显差别。,肽酰-脯氨酰顺反异构酶可促进上述顺反两种异构体之间的转换。,肽酰-脯氨酰顺反异构酶是蛋白质三维构象形成的限速酶，,第五节 蛋白质转运,一蛋白质分泌的细胞运输过程,蛋白质分泌：蛋白质从细胞内释放到细 胞外空间的过程,分泌过程：细胞质核糖体粗面内质网 形成输送小泡高尔基体 形成分泌小泡靶部位 或泡吐到细胞外部,蛋白质合成后的靶向输送,蛋白质合成后需要经过复杂机制，定向输送到最终发挥生物功能的细胞靶部位，这一过程称为蛋白质的靶向输送。,蛋白质的靶向输送(protein targeting),所有靶向输送的蛋白质结构中存在分选信号，主要为N末端特异氨基酸序列，可引导蛋白质转移到细胞的适当靶部位，这一序列称为信号序列 。, 信号序列(signal sequence),二蛋白质转运理论,真核生物运送蛋白质的方式： 信号肽引导的经内质网运送途径 经导肽引导的运送途径,翻译转运同步 翻译后转运,三.与靶向输送相关的分子 -分子伴侣（chaperon),分子伴侣是细胞一类保守蛋白质，能 识别肽链的非天然构象，通过与疏水 肽段结合和释放作用（消耗ATP),消 除蛋白质不正确的叠折，促进各功能 域和整体蛋白质的正确折叠。,热休克蛋白 (heat shock protein, HSP),常见hsp70 hsp60 功能:结合尚未离开核糖体的新生肽链或正 在穿膜的肽链,防止肽链疏水段错误 聚集,有利于肽链的正确折叠.,六.蛋白的靶向输送过程,(一).分泌蛋白的靶向输送,真核细胞分泌蛋白前体合成后靶向输送过程：,细胞质核糖体粗面内质网形成输送小泡高尔基体形成分泌小泡泡吐到细胞外部,1.信号肽(signal peptide),各种新生分泌蛋白的N端保守 的氨基酸序列称信号肽。,多数信号肽位于肽链N端，也有位于位于中部的。,靶向输送蛋白的信号序列或成分,导肽,导肽,信号肽的一级结构,10-15 -螺旋,2.分泌性蛋白信号肽的作用( function of signal peptide),将肽链引向并跨过内质网膜.这个过 程需要信号肽识别颗粒 (signal recongnition particle SPR)及受体 协助.,信号肽引导真核分泌蛋白进入内质网,目 录,蛋白转运因子,hsp70,信号肽引导真核分泌蛋白进入内质网,信号肽靶向引导肽链进入线粒体,(二).导肽理论,线粒体,叶绿体等细胞器的膜蛋白是 由导肽牵引和定位的.是肽链先合成后再分选 和运输的.,(1).碱性氨基酸含量丰富,分散于不带 电荷的氨基酸中. (2).缺失带有负电的酸性氨基酸残基. (3).有形成两性-螺旋的能力,1.导肽特征:,线粒体蛋白的靶向输送,目 录,导肽,Hsp60替换Hsp70,(三)细胞核蛋白的靶向输送,目 录,肽链转位，输入因子解聚,4-8氨基酸,GTPase,1.核定位序列不一定位于N端. 2.蛋白质定位后核定位序列不被切除. 3.需要核输入因子协助，它是核定位信号的 受体，具有GTPase酶活性（又称Ran蛋白）,细胞核蛋白的靶向输送特点：,功能蛋白质的研究进展,一蛋白质工程的概念和技术路线,蛋白质工程：,1981年,美国基因公司Ulmer提出,是指通过对蛋白质化学,蛋白质晶体学和动力学的研究获取关于蛋白质理化等各方面的信息,在此基础上对编码该蛋白的基因进行有目的设计改造,并通过基因工程等手段将其进行表达和分离纯化,最终将投入使用.,蛋白质工程基本步骤,分离纯化目的蛋白,对目的蛋白进行氨基酸测序,晶体衍射,核磁共振进行分析,获得结构和功能的数据.,（一）蛋白质工程研究的一般规律,(二)蛋白质工程和基因突变,对蛋白质的改造水平: 蛋白质水平 基因水平,指对生产出的蛋白质进行加工和修饰,如磷酸化,糖基化等. 缺点:反应条件剧烈 专一性不强. 操作量大.,蛋白质水平改造:,根据目的对编码蛋白质的基因进行改造, 小大改变一个核酸大到改变某一结构域的编 码序列.常使用基因诱变技术.,基因水平的改造:,定点诱变,专一改变基因中某个或某些特定氨基酸的技术，产生工业或医药所需的蛋白质,二蛋白质的功能域及模拟肽,(一)功能蛋白质的结构特点:,1.结构域:.分子量大的蛋白质三级结构常 可被分成一个或一个以