逆转录病毒Retrovirida.ppt

逆转录病毒 Retroviridae,病原生物学教研室,逆转录病毒的分类及其代表病毒,逆转录病毒的共同特性： 1.病毒为球形，有包膜，表面有刺突，(与病毒的吸附和穿入有关)。 2.基因组为单正链RNA双体结构。 3.病毒体含逆转录酶。 4.具有gag、pol、env三个结构基因。 5.病毒增殖的突出特点是在复制病毒RNA时要通过DNA复制中间型 (DNA replicative intermediate)。并与宿主细胞的染色体整合。,第1节 人类免疫缺陷病毒 人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)是获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)的病原体，俗称艾滋病。 HIV主要有两型： HIV-1型：即通常称谓的HIV，世界上的AIDS多由HIV-1所致； HIV-2型：1986年在西非发现一种与HIV-1不同的逆转录病毒，两者的核苷酸序列差异超过40%，称为HIV-2型，只在西非呈地区性流行。,形态结构,核衣壳 核酸：两条ssRNA与核衣壳蛋白(P7)结合形成双体结构 衣壳：双层壳膜 内层为衣壳蛋白（P24) 外层为内膜蛋白（P17) 包 膜 脂质双层 刺 突 gp120,gp41,生物学性状,形态结构,病毒基因组全长约9200bp，其5端和3端各有一段相同的核苷酸序列，是长末端重复序列(LTR)，中间含有env 、pol、gag 3个结构基因和tat、rev、nef、vif、vpu、vpr等6个调节基因。,生物学性状,基因组结构与功能,结构基因 env基因：编码gp41：介导病毒包膜与宿主胞膜的融合； gp120：有病毒颗粒与NT抗体及宿主细胞表面 的CD4分子结合的部位。 pol基因：编码产生逆转录酶(p66/ p53)和整合酶(p31)，与 病毒的复制有关。 gag基因：编码产生蛋白前体，经酶解后形成3种蛋白(P17、 P24、P15)。 调节基因： tat、rev、nef、vif、vpu、vpr tat、rev和nef的产物对HIV表达的正、负调节以及对维持 HIV在细胞中复制平衡和控制HIV潜伏有重要意义。 长末端重复序列(LTR)：对病毒转录的调控起关键作用。,生物学性状,基因组结构与功能,病毒的复制,生物学性状,病毒变异性 HIV基因组可发生变异，最易变异的是编码包膜糖蛋白的env基因和调节基因nef。 估计病毒env基因核苷酸变异概率每年每个位点约0.1%，其变异率与流感病毒相似。 根据nef基因序列的异同将HIV-1分为M、O、N等3组(group)12个亚型(subtype)；HIV-2型为AF等6个亚型。 在非洲主要流的是HIV-1的 A、C、D、和E亚型，我国云南省感染者主要为B和C亚型。全球流行将以C和E亚型为主，另外各亚型的流行时间和传播情况也不同。,生物学性状,HIV仅感染表面有CD4受体的细胞。实验室中常用正常人T细胞分离病毒。感染病毒的细胞出现CPE。动物模型可用HIV感染恒河猴和黑猩猩。,培养特性,生物学性状,56加热 30min； 冻干血制品需68 72h方能保证污染病毒的灭活； 高压蒸气灭菌（103.4kpa/121.3）20min可被灭活； 10%漂白粉液、0.5%次氯酸钠、50%乙醇、35%异丙醇、0.3%H2O2、0.5%来苏等消毒液中室温10min保证完全被灭活。,抵抗力,HIV的抵抗力不强，以下条件可被灭活：,生物学性状,致病性与免疫性,传染源和传播途径,传染源 a）HIV无症状携带者 b）艾滋病患者,2）血液传播：医源性 吸毒者,1）性传播：STD之一 同性恋 异性恋,3）母,致病性与免疫性,婴传播：胎盘 产道 哺乳,1)原发感染,致病性与免疫性,HIV进入机体后病毒开始复制，约在812w时出现病毒血症，此期病毒在体内广泛播散，并开始在淋巴样器官种植，36w在许多病人（50%70%）体内发展成急性单核细胞增多症样表现，其后大多数病毒以前病毒的形式整合于宿主细胞染色体内，进入长期的、无症状的潜伏感染期。,2) 潜伏感染,致病性与免疫性,此期可长达6个月至10年。临床无症状，有些病人可出现无痛性淋巴结肿大。当机体受到各种因素的激发使潜伏感染的病毒再次大量增殖而引致免疫损害时，才出现临床症状，进入AIDS相关综合征期。,临床表现,3)AIDS相关综合征,致病性与免疫性,临床表现,(AIDS-rilated complex,ARC) 早期有发热、盗汗、全身倦怠、体重下降、皮疹及慢性腹泻等胃肠道症状，并有进行性淋巴结病及舌上白斑等口腔损害。,4)典型AIDS,致病性与免疫性,临床表现,出现中枢神经系统疾患; 合并各种条件致病菌(如分枝杆菌、念珠菌、卡氏肺孢菌等)或其他病毒(如EBV，CMV、HHV-8型等)感染； 并发卡波济肉瘤(Kaposi sarcoma) 。 在感染后10年内约有50%的人会发展为AIDS。AIDS的5年间死亡率约为90%，多于临床症状出现后2年内死亡。,HIV的致病机制 1）选择性地侵犯CD4+T 细胞，CD4/CD8比例倒置，导致免疫功能紊乱。 2）HIV感染后B细胞多克隆活化，出现高丙球蛋白血症，循环血中免疫复合物及自身抗体含量增高，但对新抗原刺激的应答受到很大阻碍。 3）单核巨噬细胞也表达少量CD4分子，受HIV感染后通常不被杀死，成为感染后较长时期的病毒储存者。 4）HIV感染所致神经细胞损害：约有4090的AIDS患者出现不同程度的神经异常，包括HIV脑病、脊髓病变、周围神经炎和严重的AIDS痴呆综合征。,致病性与免疫性,HIV对CD4+T 细胞损害的机制 1）病毒感染对细胞的直接杀伤作用 a.病毒包膜糖蛋白插入细胞膜或病毒的出芽释放，增加了细胞膜的通透性； b.HIV增殖时可产生大量未整合的病毒cDNA,干扰细胞的正常生物合成； c.感染T细胞表面的gp120与非感染细胞的CD4结合，细胞融合死亡，T细胞减少。 2)免疫病理所引起的细胞损伤： a.受染细胞膜上表达病毒的包膜糖蛋白，可激活特异性CTL的识别，或与特异 性抗体结合后通过ADCC作用而破坏细胞； b.HIV的gp120与细胞膜上的MHC类分子有一同源区，抗gp120抗体能与这类 T细胞起交叉反应，即病毒诱导的自身免疫使细胞造成免疫病损害或功能障碍。 3)HIV感染诱导细胞凋亡： 病毒激活T细胞凋亡基因，表达FAS受体，当其与细胞表面FAS结合后最终导致 感染细胞死亡。,致病性与免疫性,3.机体对HIV感染的免疫应答 机体感染HIV后产生多种抗体，包括抗gp120等中和抗体。HIV感染也可刺激机体细胞产生免疫应答，包括CTL细胞、NK细胞及ADCC的杀伤活性，但细胞免疫依然不能清除有HIV潜伏感染的细胞，这与病毒能逃逸免疫作用有关，如: HIV损伤CD4细胞，使整个免疫系统的功能失效； 病毒基因整合于宿主细胞染色体中，细胞不表达或少表达病毒结构蛋白，使宿主长期呈“无抗原状态； 病毒包膜糖蛋白的一些区段的高变异性，致使不断出现新抗原而逃逸免疫系统的识别； HIV对各种免疫细胞均有损害。故表明机体的免疫力不足以清除病毒，HIV一经感染便终生携带病毒。,致病性与免疫性,HIV感染早期呈病毒血症时，从病人血液、脑脊液和骨髓细胞中能分离到病毒，从血清中查到HIV抗原； 无症状的潜伏期内一般不能或很少从外周血中检测到HIV抗原； 进入AIDS相关综合征或典型AIDS期，于外周血中均可查到病毒抗原、核酸及抗体。,微生物学检查法,检测抗体 ELISA、IFA、RIA: 敏感性好，应用方便。尤其ELISA法目前最为常用。但由于HIV的全病毒抗原与其他逆转录病毒（HTLV）有交叉反应，而且病毒系芽生释放，病毒包膜中常带有细胞成分，故有一定的假阳性。因此，这类试验仅适用于筛查HIV抗体. Western Blot（WB）: HIV抗体阳性者进一步用WB法予以确认。,微生物学检查法,检测病毒及其组分 病毒分离 ：取新鲜分离的正常人淋巴细胞或脐血淋巴细胞接种病人的 血液单个核细胞、骨髓细胞、血浆或脑脊液等标本。培养24周，细胞病变出现后，可用间接免疫荧光法检测培养细胞中的病毒抗原，或用生化方法检测培养液中的逆转录酶活性。 检测病毒抗原 ：常用ELISA法检测衣壳蛋白。P24多出现于HIV感染的急性期，而在潜伏期中为阴性，到出现典型的艾滋病症状时，p24 又可重新升高。 检测病毒核酸： 应用核酸杂交法检测整合在细胞中的前病毒DNA片段，可确定细胞中HIV潜伏感染的情况。应用PCR检测HIV的前病毒DNA，或用逆转录-PCR法检测病毒的RNA。,微生物学检查法,防治原则,WHO和包括我国在内的许多国家都制定了控制HIV感染的措施： 建立HIV感染和AIDS的监测网络，控制疾病的流行蔓延； 进行广泛的宣传教育，取缔娼妓，防止性传播疾病的流行，抵制吸毒等社会弊病； 检测高危险人群包括供血员、同性恋、静脉注射毒品成瘾者、血友病患者，国外旅游者和外事使馆人员等； 禁止进口血液制品，如凝血因子等； 加强国境检疫、留检等。,疫苗研究 尚缺乏理想的疫苗,目前研究得最多的是： 1.基因工程亚单位疫苗: HIV的包膜糖蛋白gp160,gp120和gp41已在细菌、酵母和真核细胞系统表达成功，免疫人和动物后可诱生特异性中和抗体和激发特异性T细胞免疫反应，在黑猩猩实验中已证明有保护作用。 2.合成寡肽疫苗 根据gp120分子中的主要中和决定簇（V3区）、与CD4受体结合区（C4区）和部分T细胞决定簇（C1、C4区）的氨基酸顺序，合成各种HIV的寡肽疫苗。在实验中已证明V3肽可以刺激动物和人产生抗HIV的中和抗体和细胞毒T细胞反应。 3.重组病毒载体活疫苗 用痘苗病毒、腺病毒和脊髓灰质炎病毒疫苗株作载体，将HIV基因插入构建成重组病毒载体疫苗。动物试验已证明能产生特异性细胞免疫和中和抗体。用表达HIVgp160、gp120蛋白的重组疫苗病毒接种志愿者后，可以产生较强的T细胞免疫反应，但体液免疫相对较弱。,防治原则,AIDS的治疗 阻止HIV吸附穿入的重组可溶性CD4分子(rsCD4)的使用； 给予抑制病毒逆转录酶活性的核苷类似物如叠氮胸苷(azidothymidine,AZT),双脱氧肌苷(2，,3，-dideoxyinosine,DDI)与2，,3，-双脱氧肌苷(2，,3，- dideoxyinosine,DDC)等； 非核苷类逆转录酶抑制剂，如德拉维拉丁(Delaviradine)和耐维拉平(Nevirapine)等，国内多用施多宁； 近年来研制的蛋白酶抑制剂，如佳息患、赛科纳瓦(sapuinavir)、瑞托纳瓦(ritonavir)以及英迪纳瓦(indinavir)等； 免疫调节剂，如IFN-，IL-2和胸腺素等。 “鸡尾酒疗法”：联合交替使用2种HIV逆转录酶抑制剂和1种HIV蛋白酶抑制剂，可有效地把血液中的HIV含量减少到最低(外周血中测不出HIV或其RNA)，因而能减轻症状及延缓生命。但无法清除整合在CD4+细胞染色体上的前病毒，因此仍不能从体内彻底清除HIV。,防治原则,第2节 人类嗜T细胞病毒 在逆转录病毒中大部分属于RNA肿瘤病毒，感染细胞后不引起CPE，而是引起细胞转化，诱发肿瘤。 1978年从T细胞白血病患者的淋巴结和外周血淋巴细胞中，观察到一种有中央位类核的C型病毒颗粒，命名为人类嗜T细胞病毒(Humun T-cell lymphouopic nirus, HTLV)或人类T细胞白血病病毒(Human T-Cell laukemia mirus, HTLV)。 后从1例毛细胞白血病患者的外周血中分离出另一种嗜T细胞病毒，称为HTLV-型。将最初发现的称HTLV-型。,HTLV-和HTLV-在电镜下呈球形: 核衣壳：核心：RNA与逆转录酶； 衣壳：含有P24和P18两种结构蛋白； 包膜： 刺突：糖蛋白 (gp120)，能与细胞表面的CD4分子结合。 病毒基因组两端均为LTR，中间从5端至3端依次排列为gag、pol、env 3个结构基因和tax、rex 2个调节基因。结构基因的功能与HIV基本一致，调节基因的产物除有增加病毒基因的转录和调节病毒基因产物表达作用外，尚能激活细胞的IL-2基因和IL-2受体基因的作用。 HTLV-型和型的基因组的同源性约50%。,生物学性状,成人T细胞白血病(adult T-cell leukemia,ATL) ： HTLV-型引起，多为40岁以上的成人发病。T细胞大量增生，转化、癌变，淋巴结及肝、脾肿大，并发高钙血症、皮肤红斑、皮疹、结节等，预后不良。 HTLV-型相关脊髓病 (HTLV- associated myelopathy,HAM) 及热带痉挛性下肢轻瘫 (tropical spastic paraparesis,TSP)： HTLV-型引起，因两者相似，故总称HAMTSP。HAM以女性居多，主要症状为慢性进行性步行障碍与排尿困难，有时伴有感觉障碍。用激素和IFN治疗可缓解。,致病性,致病机理： 传播途径： 水平传播：可通过输血、注射、性交等方式； 垂直传播：通过胎盘、产道和哺乳等途径在母 婴间。,致病性,病毒分离与鉴定 采取患者新鲜外周血分离淋巴细胞，经PHA处理后，加入含有IL-2的营养液继续36w，然后用电镜观察细胞中的C型病毒颗粒，并检查细胞培养液上清的逆转录酶活性，最后用免疫血清或单克隆抗体进行病毒鉴定。,微生物学检查法,抗体检测 1.ELISA法 用HTLV-/病毒作抗原，加患者血清孵育后再加酶标记的抗人Ig