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河北北方学院学士论文 学号：20071040107河北北方学院毕业论文加减三黄汤对感染大肠杆菌鼠的转化生长因子-、il-1的影响the effects of transforming growth factor-and il-1on resistance e.coli from mice by modified three yellow soups姓 名：张旭光指导教师：尹秀玲院 系：动物科技学院动物医学系专 业：动植物检疫年 级：2007级论文提交时间：2011年6月9日2目录引 言31 材料与方法41.1 材料41.1.1 试验药品 41.1.2 试验菌株 41.1.3 仪器设备41.1.4 试验动物 41.1.5试剂 41.2 方法41.2.1 试验菌液的制备 41.2. 2 抑制剂配方的制定及提取物的制备 51.2. 3 最小抑菌浓度的测定 采用试管两倍稀释法，对所制备的中药mtys提取物51.2. 4 药物敏感性的测定51.2.5 中药抑制剂与耐药性大肠杆菌使用量的确立51.2.6 分组与模型制作 61.2.7 相应测定体重变化脾、肝免疫指数 61.2.8 血液采集与血清制备61.2.9组织匀浆制备，血清及组织匀浆因子检测转化生长因子试剂盒检测免疫力 61.2.10 统计结果，确定中药组方疗效 82 结果82.1组菌的抑菌作用方中药对耐药性大肠杆菌 82.2 中药抑制剂在机体中最佳使用剂量82.3 耐药大肠杆菌最佳攻毒量82.4 实验期间各组死亡情况与疗效结果82.5各组肝指数和脾指数的测定结果92.6中药抑制剂对感染大肠杆菌鼠的某些生化指标影响92.6.1肝功能方面9表3 中药抑制剂对感染大肠杆菌鼠的某些生化指标影响102.6.2 肾脏功能112.6.3 免疫 112.6.4血淀粉酶（hd）112.7 血清及组织细胞因子检测112.7.1 转化生长因子对小白鼠免疫功能的影响112.6.2白介素1-对鼠免疫功能的影响123讨论123.1 组方中药的抑菌作用123.2促进机体免疫器官的发育，提高机体免疫力123.3 保肝利胆，保肾排毒133.4血清及组织细胞因子检测144结论14参考文献15致谢172加减三黄汤对感染大肠杆菌鼠的转化生长因子-、il-1的影响张旭光动物科技学院07级动植物检疫专业本科班指导教师：尹秀玲摘要：目的：讨探加减三黄汤对多重耐药人源性大肠杆菌的影响感染鼠的免疫指标的影响。方法：确定加减三黄汤（2g/ml）对致病性高度耐药的人源大肠杆菌2952(o142+o26+o13)的接种量以原液的0.5ml（2.4109cfu）。选取健康的30日龄小鼠30只，随机分为健康组，阳性对照组和攻毒治疗组。自感染试验菌第1天起，试验组每只小鼠每天分别灌服中药制剂提取物0.5ml，连续7d。在感染后第8d，随机抽取测定生化指标，剖检测定免疫器官指数，血清及转化生长因子-、il-1因子的含量。结果：加减三黄汤对人工感染耐药e.coli后小鼠生化指标有显著的影响，能够促进机体免疫器官的发育，提高机体免疫力；能显著降低血清中alt、ast、glu的含量，具有保肝利胆作用；igg、iga和igm的提高、恢复，不同程度的增加了免疫力。可以显著提高血清及转化生长因子-、il-1因子的含量影响肝脾的恢复。结论：加减三黄汤对人源多重耐药性大肠杆菌能起到一定的耐药逆转作用，对动物机体具有一定的免疫保护作用。关键词：人源耐药性大肠杆菌 转化生长因子- il-1the effects of transforming growth factor-and il-1on resistance e.coli from mice by modified three yellow soups zhang xuguang(animal and plant quarantine, college of animal science and technology )instructor：yin xiulingabstract:objective: please agent mtys soups (modified three yellow multidrug) on the influence of resistance of e. coli infected mice immune index effects. methods：the 2g/ml inoculum of multiple drug resistance to2952 e. coli was determined and inoculated by 0.5ml (2.4 109cfu) in vivo test. the30 30-day-olds mice fowl were randomly arranged into 3 groups, the positive control and experiment group were inoculated with the 0.5ml extractive of mtys each day for seven days. after the eight days, some mice fowl were randomly taken from each group for detecting blood serum biochemical indicator , immune organ index and the content of serum and organization of cytokines il -1, transforming growth factor-(tgf-). results: mtys had very obviously effect on biochemical indicator on mice fowl which were artifical infected resistant e.coli. it could promote growth of the immune organs(thymus and bursa of fabricius) and immunity in silky fowl; reduce obviously the contents of alt、ast and glu in blood-serum; protect liver and choleretic effect; igg, iga and igm improvement, rehabilitation, varying degrees of increase in immunity. cytokines il-1and transforming growth factor-; content were increase significantly of serum and tissue factor, then effect the recovery of the liver and spleen. conclusions: mtys had obviously inhibitory effect to resistant multidrug e.coli and immunoprotection on creature.key words: the resistant e.coli isolated from human il-1 tgf-引 言大肠杆菌是畜禽和人类的重要致病菌，对畜牧业生产和人类健康都有着严重的影响。在临床防治过程中，随着抗生素等抗菌药物的大量使用，大肠杆菌耐药菌株也在不断出新，耐药谱也在不断扩大，有的菌株甚至对临床上刚研制的新型抗生素也表现出极强的耐药 1，在养殖业和食品卫生中形成了严重的恶性循环。随着大肠杆菌耐药株的不断增多，大肠杆菌感染及其食品污染有不断上升的趋势，尤其是人类食物中毒和胃肠炎的不断暴发已成为全球关注的焦点，因此，控制耐药菌的传播和防治细菌感染己成为一个世界性难题。虽然人们不断开发出新的抗菌谱更广的药物，如头孢类、新喹诺酮类药物，在临床上也有非常理想的报道，但在若干年后仍然可能变得毫无用处。据报道2-3，经常食用含药物残留的动物性食品，动物体内的耐药菌株可通过动物性食品来传播给人类，给人类治疗疾病带来困难，特别是耐药性大肠杆菌的感染往往可以延误疾病的正常治疗。目前对多重耐药性大肠杆菌抑制剂的研究已有很多报道，但对抗耐药性大肠杆菌中药抑制剂的研究报道较少。我国有着得天独厚的中药资源，中药在治疗感染方面显示了独特的作用，同时中药具有资源丰富、作用靶位多、毒副作用较小、价格便宜及体内使用安全等优点。中草药的活性成分可抑制耐药性大肠杆菌主动外输系统，使耐药性大肠杆菌消除其耐药性4-5。本实验先通过在体外对人源大肠杆菌进行临床分离细菌鉴定、分离培养、血清型鉴定和耐药性检测，然后再将分离鉴定的菌株回归到动物体内，对鼠的免疫力和某些免疫因子进行检测，获取有效组方应用于临床，可为该病今后防治提供一定依据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 试验药品 黄连、厚朴、苦参、大青叶、穿心莲、黄芩、黄柏、木香、甘草、黄芪、茯苓、均购自张家口医药公司。营养肉汤 北京海淀区微生物培养基制品厂生产麦糠凯琼脂 北京陆桥技术有限责任公司生产1.1.2 试验菌株 经临床分离5-6生化鉴定的人源大肠杆菌进行血清型鉴定，获得致病性高度耐药的人源2952(o142+o26+o13)大肠杆菌7。（北京天坛生物制品检定所鉴定，本室保存）。1.1.3 仪器设备 旋转蒸发器、ldzx-40b1型不锈钢立式自动电热蒸汽压力灭菌器、szx-01型超静工作台、skp-01型电热恒温培养箱、电子天平、微量加样器、旋爱林牌wzrx1微量吸液器(苏州市东吴医用电子仪器厂)、cap-ria 16 gamma counter （美国产）、ft-614混匀器(核工业部北京和仪器厂）、hh-w21-420bs电热很温水浴箱（上海跃进医用光学器械厂）、541-10000-00-0 heidolph 振荡器 reax top glasblasreei-krankenhausbedarf laboreinrichtungen. hassa laborbedarf 1.1.4 试验动物 30只30日龄小鼠 购自河北北方学院附属实验牧场1.1.5试剂 碘125i白细胞介素1放射免疫分析药盒，北京普尔伟业生物科技有限公司；碘125i转化生长因子-放射免疫分析药盒，北京普尔伟业生物科技有限公司。1.2 方法1.2.1 试验菌液的制备 将分离并筛选2952(o142+o26+o13)菌株8进行复苏培养18h24h。在无菌操条件下，吸取20ul菌液，接种于含2.0ml营养肉汤培养基试管中，按10-1、10-2、10-3、，十进位稀释，置37培养。每种菌株做两个重复。采用显微镜直接计数法进行活菌计数，配成约含菌量为109cfu/ml的菌悬液。1.2. 2 抑制剂配方的制定及提取物的制备 根据传统中药理论和配伍原则及三黄汤配方进行加减，制成如下配方：中药制剂（mtys）黄芩12g、黄连12g、黄柏12g、穿心莲9g、苦参9g、金银花15g、大青叶15g、木香6g、甘草9g、厚朴9g、黄芪9g、茯苓9g。1.2. 3 最小抑菌浓度（mic）的测定 采用试管两倍稀释法，对所制备的中药mtys提取物需先测定其对2952(o142+o26+o13)菌株的mic值，细菌接种量约为109cfu/ml，同时做阴性、阳性对照，每一浓度药液做两个平行，以平均值为最终结果。同时将各培养细菌划线接种于相同中药浓度营养琼脂培养基上，再次观察各菌株的药敏试验结果并记录。判定标准为：无大肠杆菌生长的最小药液浓度为该药物对该菌株的最小抑菌浓度（mic）。1.2. 4 药物敏感性的测定 采用打孔法测定中药mtys对上述菌株的抑菌圈直径，受试菌株为2952(o142+o26+o13)菌株， 在4mm 厚的营养琼脂平板上打6mm的孔，每孔间距为30mm，将调制好的菌液（相当于109cfu/ml），用灭菌玻璃棒均匀涂抹在琼脂板上；然后每孔加mtys中药药液100l（2g/ml），37培养2024h，观察结果。抑菌圈直径20mm高敏、抑菌圈直径1019mm为中敏，抑菌圈直径10mm为不敏感。1.2.5 中药抑制剂与耐药性大肠杆菌使用量的确立 1.2.5.1 大肠杆菌生长强度的测定 采用平皿稀释法测定2952(o142+o26+o13)菌株在mtys中药营养琼脂上的生长强度。在无菌条件下，中药提取物和营养琼脂按19的比例制作平板，冷却凝固15min，分别在平板上接种上述菌种菌液（相当于109cfu/ml），每个菌种3个重复，同时与无药琼脂作对照，37培养1618h。观察细菌生长情况，结果判定：以对照琼脂的生长为4个“”，生长强度越低“”越少，无菌生长为“”。1.2.5.2 中药抑制剂在机体中使用剂量的确立 取30只体重均匀的30日龄小白鼠，随机分为6组，每组5只，各组小白鼠分别灌服不同计量的mtys 中药提取物，1次/d，用药期7d，停药2d，第40天称其体重，求其平均值。每天观察每组鼠的采食、饮水、行为及死亡情况，并对精神沉郁鼠和死亡鼠进行剖检和细菌培养，以确定mtys的用药量。1.2.5.3 耐药大肠杆菌最佳攻毒量的确定 取20只体重均匀的7日龄小白鼠，随机分成4组，每组5只，按组分别腹腔注射不同剂量2952(o142+o26+o13)菌株菌液，每天观察每组小鼠的采食、饮水、行为及死亡情况，观察10d，死亡鼠作病理剖检和菌检，确定死亡原因，最后计算死亡率。1.2.6 分组与模型制作 取初生小鼠30只，常规饲养30d后，随机分为3组：健康组、阳性对照组、mtys组、每只称重编号，分组饲养。供给全价配合饲料，自由采食和饮水，每天观察小鼠的临床表现。在攻毒前每组随机抽取2只，做剖检观察和细菌培养。然后根据预试验的结果，阳性对照组、mtys组每只小鼠腹腔注射试验菌液0.2ml，约含菌1.6109cfu，健康组腹腔注射生理盐水0.2ml。接种后8h出现典型症状时开始给药，治疗组以相当于生药2g/kgw灌服，连用7天，每日上午1次，常规饲喂，试验期为8d，每天观察小鼠的临床表现，试验第8d逐只进行称重并剖检。1.2.7 相应测定体重变化脾、肝免疫指数 攻毒喂药后第8d，分别从各组小鼠中空腹称重，统计mtys对小白鼠增重的影响，然后屠宰，摘取肝、脾称重，计算其免疫器官指数（免疫器官重宰前空腹活重100），即以免疫器官的克数占千克体重的份额（g/kg）表示。各组鸡在感染前和试验结束时分别称重1次，测定胸腺重，根据小鼠的体重变化，计算每组小鼠的平均体重和标准差。1.2.8 血液采集与血清制备 在试验感染后第8d，每组随机抽取5只小鼠，禁食812h，心脏采血3ml，在37恒温水浴30min，3000r/min离心10min分离血清。做血清因子检测。用移液枪吸取血清，标号待测。igg、iga、igm的含量采用免疫比浊法，以上在日立7150型全自动生化分析仪上测定9。均在河北北方学院一附院检验科测定。1.2.9组织匀浆制备，血清及组织匀浆因子检测转化生长因子、il1试剂盒检测免疫力 按照说明书方法，鼠(mice）il1放射免疫试剂盒：1.2.9.1血清：取静脉血2m1,注入试管待凝固后，4 3000rpm离心，10min,分离血清。放-20，样品可保存2个月，放-70以下可存放半年。测定前使样本置于室温或冷水中复融， 再次403000rpm离心，5 min,取上清测定。1.2.9.2组织：取出活组织，吸去血迹，称重，尽快加入生理盐水1ml碾磨，制成匀浆，43000rpm离心，15min,取上清，-20以下保存。测定前最好做预实验确定样品稀释度。取3-5份做小样，可将样品做原倍，1：5，1：20倍稀释，选择合适的稀释度。 另外，每种组织的样品非特异结合（u0）可能有些差异，每份标本最好申独做一个u0或每组做一个u0。取组织的重量一般在300-400mg左右为好。 1.2.9.3细胞培养液或其它体液：如样品浓度高，可直接加样测定，如浓度低需将样品浓缩5-10倍，再加样测足，可取样品0.5ml，加入测量用的放免塑料管中再冷冻干燥机上冷冻抽干，用0.1 ml生理盐水复融，做为样品管直接测定。测定方法 本实验采用平衡法，取聚苯乙烯试管编号，按下表操作。 il-1 ria加样程序（l）试剂 t nbs s0 s1s5 样品 u0缓冲液 200 100 100标准液 100 待测样品 100 100抗血清 100 100 100 125i-il-2 100 100 100 100 100 100 充分混匀4放置24小时 pr分离剂 500 500 500 500 500 充分混匀，室温放置20min, 4 3500rpm离心25min,吸弃上清，测个沉淀管，cpm数。1.2.9.4结果计算：以b / bo为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，在 logit-log坐标纸卜绘制标准曲线，根据样品b / bo%,从标准曲上查出样品的含量。日前多用自动计数器预先编制好程序直接给出有过参数、标准曲线、样品浓度。 nsb（nsb管的cpm数t管的cpm数） 100% bo%=（bo管的cpm数一nsb管的cpm数）t管的cpm数100 bbo（标准或样品管的cpm数nsb管的cpm数（bo管的cpm数ns管的cpm数）100 组织样品得出样品浓度后，再根据称取组织量，计算出每mg组织中的量。尿液样品从每ml浓度再计算出每小时或每分钟排出量。1.2.10 统计结果，确定中药组方疗效 所有实验数据均用t检验软件进行分析，计量资料以s表示，并进行t 检验分析。2 结果2.1组菌的抑菌作用方中药对耐药性大肠杆菌 mtys对2952(o142+o26+o13)菌株的mic值为62.5g/l。抑菌直径30.9mm为高敏，mtys无细菌生长。2.2 中药抑制剂在机体中最佳使用剂量 为了在体内试验时，中药mtys提取物的浓度能够在体内达到一定的药物浓度，又不影响机体的正常发育，中药mtys的使用剂量，30日龄以每只鼠0.5ml为宜。2.3 耐药大肠杆菌最佳攻毒量 耐药性大肠杆菌2952(o142+o26+o13)菌株每只小鼠的接种量以原液的0.2ml（1.6109cfu）为宜。2.4 实验期间各组死亡情况与疗效结果2.4.1自然死亡情况 在攻毒前对随机抽取的小白鼠在无菌条件下剖检观察和细菌培养，没有发现感染大肠杆菌。说明，人工造模是在没有感染大肠杆菌的前提下进行的。在人工病模试验，治疗组和细菌感染组鼠在攻毒后8小时，部分小白鼠出现不同程度的大肠杆菌临床症状，主要表现为精神不振，轻度腹泻、食欲减退，严重者食欲废绝等。阳性对照和用药组均在感染18h后开始死亡，治疗后的第5天临床病症明显减轻，而阳性对照组从攻毒开始至第8天，临床症状严重者陆续死亡，到第9天存活鼠临床病症基本消失。2.4.2疗效 试验结束后增重情况 从表1可以看出，阳性对照试验结束时增重最少为27.9% ，阳性对照组和给药组差异显著（p0.05）；给药组与健康组之间差异极显著（p0.01）。死亡率、有效率和治愈率，阳性对照组、实验组，从治疗开始到第10天结束时鼠只死亡率分别为50%和36%，健康组鼠的死亡率为0。由此可见，鼠的死亡率，阳性对照与给药组之间有效率存在显著性差异（p0.05）。经过治愈阳性对照组和mtys给药组、存在差异（p0.05）。 表1 各试验组鼠的疗效结果组别死亡率(%)有效率(%)治愈率(%)试验开始重(g)期末重（g）增重率(%)健康组0-20.5225.42c100d阳性对照组50*50*#30*#18.2219.2227.9a攻毒治疗组366445a*20.0224.02a51.2b注：各观察纵项指标之间“*”表示差异显著（p0.05）；“#”表示在不给药的情况下自己好转或自愈；a与b、b与c、c与d之间表示差异显著（p0.05），a与c,b与d表示差异极显著（p0.01）；相同字母表示差异不显著（p0.05）；“-”表示没有计算。2.5各组肝指数和脾指数的测定结果 表2结果显示，用药后第8d试验组小白鼠肝指数及脾指数与阳性和健康组比较差异均极显著（p0.01）；用药后第8d阳性和健康组差异不显著（p0.05）。证明mtys能够提高小白鼠的免疫功能。表2 免疫器官指数结果(g/g)组别脾指数 肝指数健康组0.0040.0020.029.0.317攻毒治疗组0.0050.0000.0670.013阳性对照组0.0030.0000.0250.124注：纵列 “a”表示与阴性对照比较差异极显著（p0.01）；“b”表示与阳性对照比较差异显著（p0.01）；小写为差异显著2.6中药抑制剂对感染大肠杆菌鼠的某些生化指标影响2.6.1肝功能方面 肝脏是物质代谢最活跃的器官，酶的含量极为丰富。肝细胞受损或肝功能障碍时，也可反映到血清中某些酶的改变，有的升高，有的降低。临床上常利用血清中某些酶的变动来衡量肝脏功能。大肠杆菌病可造成不同程度动物肝脏损伤，当肝脏发生病变时，细胞膜通透性增加，各种酶释放入血，导致酶的活性增高。mtys提取物能不能对耐药性大肠杆菌病引起的肝损伤起到保护作用，通过表3可以看出。2.6.1.1总蛋白（tp）功毒治疗组显著低于健康组，说明机体处于高耗能状态，还没有完全恢复。表3 中药抑制剂对感染大肠杆菌鼠的某些生化指标影响生化指标攻毒治疗组阳性对照组健康组cho（mmol/l） 0.770.23 a0.760.04a0.820.07bun（mmol/l）gpt（u/l）1817.07b10112.73789.89got（u/l）5427.0744541.0147514.14alp（u/l）901.4118.54.95f62.53.53tp（g/l）107.2518.17137.3546.4680.66.51igg（g/l）0.010.00a0.030.000.030.00iga（g/l）0.080.01a0.060.01b0.050.00igm（g/l）0.10.06b0.150.00ab0.050.01ldh（u/l）5736131.52576633.944593216.37hemodiastase337484.85ab1803.5146.372857197.99cre（mol/l）8118.38b5648.08544.24ck（u/l）57.514.85b780.71b106.526.16urea（mmol/l）12.141.5414.733.8310.50.37注：纵列 “a”表示与阴性对照比较差异极显著（p0.01）；“b”表示与阳性对照比较差异显著（p0.01）；小写为差异显著。2.6.1.2 谷丙转氨酶（alt）和谷草转氨酶（ast） 由表3可以看出，alt在血清中的含量，阳性对照组极显著高于阴性对照、试验组与阳性对照组比较差异显著（p0.05）。ast在血清中的含量，阳性对照组与其它各组比较均差异极显著（p0.01）。由于试验组中的alt和ast含量均低于阳性对照组，说明mtys具有抑制大肠杆菌对肝脏的损伤，对肝脏起保护作用10。2.6.1.3 碱性磷酸酶（alp）正常动物血清alp主要来自肝脏，测定血清中alp的含量是了解肝脏损害程度的又一指标。在正常情况下可经胆道排出，但当肝脏出现病变损害严重时，该酶从胆道排出受阻，同时合成减少，使血清中alp的含量迅速下降。由表3显示，阳性对照在感染后8d下降多，健康组和试验组血清中alp的含量均比其它组高，且差异显著（p0.05），同时看出，随着给药剂量的增加和治疗时间的延长，血清中alp的含量也随着增加。2.6.1.4 总胆固醇（cho） 血脂是血液中各种脂类物质的总称，其中最重要的是胆固醇和甘油三脂。肝脏合成胆固醇的能力很强，血浆胆固醇大部分来自肝脏，一部分来自食物，肝外组织合成的胆固醇一般很少进入血液。肝功能不全时，胆固醇的形成、酯化、排泄发生障碍，引起血浆胆固醇含量减少。8d血清中cho的含量，健康组和试验组均比阳性对照组高，但差异不显著（p0.05），tg的含量各组间没有明显变化，且差异不显著（p0.05）。从总体水平比较除健康组外处于下降趋势。2.6.2 肾脏功能 2.6.2.1 尿素（ur）在肾功能损害早期，尿素可在正常范围，由表3看出，不明显。2.6.2.2乳酸脱氢酶 它广泛存在于机体组织内，以心、肾、和骨骼肌最丰富，乳酸脱氢酶活性升高常见于急性心肌梗塞等病中。本实验中差异不显著，说明没有危及心脏。2.6.3 免疫 试验中igg阳性对照和阴性对照差异极显著（p0.01），和试验组差异显著。血清型iga可介导调理吞噬抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用；由表3看出，在阳性对照组igm的含量较低与其它组相比，差异显著（p0.05），功毒组中抵抗力低下。从三种免疫球蛋白结果观察，不同程度的增加了免疫力。2.6.4血淀粉酶（hd） 检查主要用于诊断胰腺炎，结果不显著。2.7 血清及组织细胞因子检测2.7.1 转化生长因子对小白鼠免疫功能的影响 小鼠经人工感染耐药大肠杆菌后，血液中阳性对照组极显著低于治疗组和健康组，肝中阳性对照组和攻毒治疗组转化生长因子的水平显著高于健康组，脾中转化生长因子的水平阳性对照组极显著高于治疗组和健康组，说明感染耐药大肠杆菌后显著降低了血液中的转化生长因子水平，极显著增加肝、脾的水平。经过治疗后，血液、脾脏的水平逐渐恢复正常，而肝内水平持续走高。表4鼠人工感染大肠杆菌治疗前后的转化生长因子量的变化(ng/mg)阳性对照组攻毒治疗组健康组血4.212.72ab11.394.4712.231.162肝9.611.35a10.360.05a6.60.5脾9.214.99a0.210.15 a0.070.11注：纵列 “a”表示与阴性对照比较差异极显著（p0.01）；“b”表示与阳性对照比较差异显著（p0.01）；小写为差异显著。 2.7.2白介素1-对鼠免疫功能的影响小鼠经人工感染耐药大肠杆菌后，血液中il1-的水平变化不明显，肝中阳性对照组高于健康组，治疗后极显著下降，脾中il1-的水平极显著高于治疗组和健康组，说明感染耐药大肠杆菌后极显著增加肝、脾的水平。经过治疗后，肝内水平下降，脾内水平持续走高。表5 鼠人工感染大肠杆菌治疗前后的 il-1量的变化(ng/mg)攻毒治疗组阳性对照组健康组血1.730.791.370.381.40.4肝1.280.40ab2.580.032.260.02脾1.380.26a 0.950.170.840.13注：纵列 “a”表示与阴性对照比较差异极显著（p0.01）；“b”表示与阳性对照比较差异显著（p0.01）；小写为差异显著。3讨论3.1 组方中药的抑菌作用 生化指标检测效果与许多报道中中药可提高机体的生长性能相似11-12。据报道，许多中草药对病菌和病毒具有抑制和杀灭的作用，而且能双向调节机体的免疫功能，促进免疫器官淋巴细胞和其它免疫细胞发生、分化、成熟、定居和增殖以及产生免疫应答，这与中药的化学成分有关。mtys提取物能够调节机体免疫力，增进食欲，这与许多报道中中药可提高机体的生长性能相似13-14。3.2促进机体免疫器官的发育，提高机体免疫力 免疫球蛋白igg、iga、igm是机体受抗原刺激后产生的，其主要作用是与抗原起免疫反应，使病原体失去致病作用。igg 是血清免疫球蛋白的主要成分，它在抗感染中起到主力军作用，它能够促进单核巨噬细胞的吞噬作用，中和细菌毒素的毒性。igm 是抗原刺激诱导体液免疫应答中最先产生，igm 在机体的早期防御中起着重要的作用。中药能够发挥其效力，多糖等有益成分，能够促进胸腺、脾脏等免疫器官的发育，增加其重量，并且能使环磷酰胺所造成的免疫抑制转至正常水平。如：安松兰15发现，黄芪多糖可明显提高经环磷酰胺处理后小鼠的脾脏及胸腺指数。又据王志祥等16报道，0.3%黄芪提取物能显著提高鼠日增重和饲料转化效率、血清谷胱甘肽过氧化物酶活性、胸腺指数和脾脏指数。甘草中甘草酸类主要表现为增强巨噬细胞吞噬功能和增强细胞免疫的作用，使iga和igg明显降低。羧甲基茯苓多糖有活化t细胞和b细胞，使免疫监视系统复活，显著降低igg、igm含量的作用，从而提高机体非特异性细胞免疫功能。3.3 保肝利胆，保肾排毒 加减三黄汤中的金银花，它的主要成分含有挥发油、黄酮类、有机酸、三菇类等。其中三股皂苷对鼠肝损伤有明显的保护作用，并明显减轻肝脏病理损伤的严重程度。金银花所含绿原酸降低肝脏甘油三酯含量，明显减轻肝脏病理损伤程度，与本试验结果相吻合。黄芩有黄芩素等对急慢性炎证有明显的抑制作用，黄芩水浸液灌胃后，有保肝、利胆作用。黄连和黄柏中的成分小檗碱可使血清胆固醇含量降低。黄芪多糖对肝损伤有明显保护作用，可引起的血清谷丙转氨酶（alt）和谷草转氨酶（ast）的升高，同时改善肝组织的病理变化。宗友等17研究了黄柏提取物可促进肝糖原合成，调节血糖浓度。大青叶具有利胆退黄，保肝护肝的作用。主要能诱导肝脏酶系统增加对胆红素的吸收、结合和排泄能力；防止肝细胞变性坏死促进肝细胞修复和再生；增强肝脏的解毒功能并有抑菌作用。茯苓有利于平衡血糖。甘草中甘草酸单胺对肝组织损伤也有改善作用18，有效地降低促肝细胞炎症变化。甘草酸二铵不但具有良好的改善肝功能的作用，还具有抗肝纤维化的作用。苦参其成分苦参碱能保护肝细胞膜性结构，从而改善肝细胞能量代谢，使肝功能明显改善，使血清atl，bun，ln均有明显改善，具有保护作用。说明苦参碱具有保护膜结构的功能。姚青等19探讨了穿心莲内酯对可卡因致肝脏毒性的保护作用，穿心莲内酯组与可使染可卡因血清alt、ldh、ast降低，肝脏的病理学损害也有明显的改善。穿心莲乙醇提取物可降低血糖。尿素氮是反映肾脏是否健康的主要指标之一，在肾脏受损时，使血清中的尿素氮含量升高。在本试验中mtys中的甘草和黄芪，具有显著减少尿蛋白量，减轻肾脏病变程度，促进肾损伤的修复，使血清中的尿素氮明显降低。3.4血清及组织细胞因子检测 3.4.1白细胞介素-i(interleukin-1il-1 a）是一种主要由单核巨噬细胞产生的重要细胞因子和多肽调节因子。主要在细胞免疫激活中发挥调节作用。il-i参与机体造血系统、神经、内分泌系统、机体炎症反应以及某些抗肿瘤生理过程il-i在局部组织内持续地异常合成，可导致机体发热、炎症反应。某些疾病的病理改变过程中，也可出现il-i含量发生变化。il-i又是急性期反应的主要诱导物，并受各种刺激因子（包括抗原、内毒索、细菌及病毒等）所诱导。故il-i具有广泛的生物学活性。il-1 (参与介导急性髓白血病,急淋白血病及多发性骨髓病。在再生障碍性贫而患者，单核细胞产生il-i能力明显降低，而在类风湿性关竹炎、结核和风湿病患者il-i产生水平较高。3.4.2 转化生长因子-是一种多肽生长因子。tgf一般在肿瘤细胞中合成较丰富，通过反转录病毒，原癌基因和化学物质使细胞转化。它与生殖和消化系统生理生化及肿瘤的发生发展等有关。因此，测定血清和体液中tgf含量，在基础医学和临床疾病的研究中是一项有价值的指标。4结论4.1加减三黄汤对多重耐药性大肠杆菌的抑菌效果较好。4.2耐药性大肠杆菌2952(o142+o26+o13)菌株鼠的接种量以原液的0.2ml（1.6109cfu）为宜。加减三黄汤使用计量，8日龄以每只小鼠0.5g/每只为宜。4.3加减三黄汤能够促进机体免疫器官的发育，提高机体免疫力，能明显降低血清中alt、ast、glu的含量，具有保肝利胆作用。igg、iga和igm的提高、恢复，不同程度的增加了免疫力。4