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生命科学学院2012届本科毕业论文编号：2012002 河南大学2012届本科毕业论文 蜡样芽孢杆菌突变体关于分泌淀粉酶的研究论文作者姓名： 作 者 学 号： 所 在 学 院： 生命科学学院 所 学 专 业： 生物工程 导师姓名职称： 论文完成时间： 2012年5月11日 2012年5月11日蜡样芽孢杆菌突变体关于分泌淀粉酶的研究 摘 要：实验通过卢戈氏碘液染色法和观察透明圈的方法，以蜡样芽孢杆菌0-9菌株为对照，对0-9菌株通过转座形成的突变体产生胞外淀粉酶能力的差异进行研究。实验结果发现，在固体淀粉培养基、30、24h培养的条件下，突变体36、38号菌产生淀粉酶的能力远大于对照组，突变体56、94号菌产生淀粉酶的能力远小于对照组。这些突变体可进一步为探索菌体胞外淀粉酶的分泌能力和菌体在小麦中的定植能力之间的关系做好准备，对小麦病虫害的防治也具有一定的意义。 关键词：卢戈氏碘液染色法 转座 蜡样芽胞杆菌0-91 前言1.1生物防治1.1.1生物防治的概念 生物防治包括以虫治虫和以菌治虫。其主要措施是保护和利用自然界害虫的天敌、繁殖优势天敌、发展性激素防治虫害等。是人类依靠科技进步同病虫草害做斗争的重要措施之一。以菌治虫是80年代新兴的生物防治技术。它是利用昆虫的病原微生物杀死害虫。这类微生物包括细菌、真菌、病毒、原生物等，对人畜均无影响，使用的时候比较安全，无残留毒性，害虫对细菌也无法产生抗药性，因此，微生物农药的杀虫效果在所有防治技术中名列前茅。1.1.2 生物防治的意义长期以来，主要通过化学农药来防治植物病害，虽然这种方法能够较快地防治疾病，但是也引起了植物病原抗药性、农药残留等问题，造成了严重的环境污染和生态破坏。植物内生细菌几乎存在于所有健康植物体内，与植物和谐共处，不仅能够避免使用化学农药给人类健康和环境带来的隐患，还能避免使用杀菌剂在杀死病原菌的同时杀死在环境中起重要作用的非靶微生物和使用其他生物菌肥破坏植物根际土壤的微生态平衡，因此有效生防菌的筛选在植物病害防治上有很大的应用潜力。当前制约生防菌利用的关键因素是抑菌活性不够强，生防菌在自然环境中定殖能力差，形不成优势生态菌群来阻止病原菌的侵染。1.2 腊状芽孢在生物防治中的作用蜡样芽孢杆菌0-9是由本实验室分离保存的小麦内生细菌，该细菌对小麦纹枯病有很强的生物防治作用。1.2.1 增强宿主竞争优势的作用竞争作用是内生芽孢杆菌在寄主体内发挥作用的重要机制之一，主要通过内生菌与病原菌相互竞争位点来夺取营养物质，从而抑制植物病害的发生。竞争作用与施用剂量、时间、定殖能力及种群建立状况密切相关。研究表明，芽孢杆菌进入植物体内的途径和方式与病原菌基本相似1，进入寄主体内以后，芽孢杆菌会优先占据病原菌的入侵点，与病原菌争夺营养，可有效降低该病原菌及其毒素的积累。1.2.2 增强宿主接抗性的作用拮抗作用是指内生菌通过同化作用产生抗菌物质抑制病原菌生长或直接杀死病原菌。芽孢杆菌能够分泌多种抗真菌和细菌作用的拮抗物质，它们对病原菌具有直接的抑制作用。刘建国等2研究发现b. cereus s1 能产生新型抗真菌环状多肽aps，抑菌实验表明，此多肽有广泛的抗菌谱且抑菌持久，对病原真菌的孢子萌发和菌丝的生长均具有显著的抑制作用。关于抑菌机制各国学者有不同的看法，有待深入研究。1.2.3 促进宿主植物生长的作用感染很多内生菌进入植物体内后，寄主植物都会表现出明显的生长作用。研究发现，内生芽孢杆菌能产生或诱导植物产生生长素 (iaa)、赤霉素 (ga3)、玉米素 (zr4) 等，这些生长激素能促进植物生长。唐文华等 (1992) 曾对7 株蜡样芽孢杆菌增产菌的发酵液进行了植物生长激素类物质的高压液相色谱分析，结果发现吲哚乙酸、玉米素和赤霉素在所有菌株中普遍存在，吲哚乙酸的含量较高且稳定，说明增产菌所产生的植物激素是其促进植物生长发育的重要原因之一3。此外，一些菌株能合成嗜铁素、有机酸等物质，促进寄主植物对氮、磷等营养元素的吸收。王东明等4筛选的蜡样芽孢杆菌6371 能转化有机氮磷，分泌有机酸，降解土壤中难溶性无机盐，分泌抗菌物质，抑制病源菌的生长，增强植物抗逆境胁迫的能力。1.2.4 帮助宿主诱导植物抗性的作用芽孢杆菌能够诱导寄主植物产生一些物理结构上的抗性（例如形成生物膜等形式），从而限制病原菌进一步侵入。benhamou等5用内生菌b. pumilus se34 预接种基因转化豌豆，然后接种病菌。在病菌企图侵入部位大量沉积木质和酚类物质，使这些部位的细胞胞壁得到加厚，有效阻止了病菌的侵入。此外，芽孢杆菌还能诱导寄主植物生理生化发生变化，积累相关蛋白，合成一些代谢产物，产生水解酶和氧化酶等(如几丁质酶、-1,3 葡聚糖酶、过氧化物酶)，从而抑制病原菌生长。蜡样芽孢杆菌便能分泌超氧化物歧化酶 (sod)，使植物产生对病原菌的抗病性。尽管国内外学者就内生芽孢杆菌对植物的上述四种作用方式形成共识，然而相关的作用机制研究仍处于探索阶段。关于内生菌对病原菌的抑制作用、增强宿主植物抗逆性作用机制的研究报导较少，多为推论性或者是间接性的6；对于内生菌在植物体内定植规律的研究尚处于探索阶段，随着分子生物学技术的发展，荧光标记技术、电镜免疫胶体金技术、酶联免疫反应技术和基因标记等技术被应用于内生菌的定殖规律研究7-10，但由于宿主植物生活环境多样性以及内生菌与宿主植物关系的复杂性，加之植物内生菌起源演化的问题尚无定论，目前对于内生细菌进入植物的途径、在植株体内的定殖传导方式、内生细菌与寄主植物的互作用、生物学功能作用机制等不是很清楚11。只有对生防菌的抗菌机制、诱导抗性促生机理等深入研究，进一步完善基础理论，才能更好地开发和利用生防菌资源。1.3 产胞外淀粉酶的菌株对生防的作用1.3.1 胞外淀粉酶的检测方法 淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称。淀粉酶能将可溶性淀粉、直链淀粉或者糖原分解为麦芽糖、糊精、葡萄糖等物质。淀粉与卢戈氏碘液产生反应生成蓝色物质，而被淀粉酶水解过生成的物质不会出现蓝色反应。由此可以在培养基中加入淀粉，然后用碘液染色，变蓝的地方说明有淀粉存在，没有变蓝的会出现一个透明的圈，这个范围内的淀粉被淀粉酶水解。故可以利用透明圈的大小来判断菌体产生淀粉酶的能力差异。 1.3.2 产胞外淀粉酶的腊状芽孢杆菌在小麦体内的定植 小麦贮存物质主要以淀粉的形式存在于胚乳中，在小麦发芽时，胚乳中的淀粉会被动用，用于为萌发提供必要的营养、能量等。在萌发期间小麦会产生大量的淀粉酶将其储存的淀粉水解，以供萌发使用。腊状芽孢杆菌为小麦根部的有益菌群，能够有效抵御外界生物的侵害。但是这种芽孢杆菌由于营养和空间的限制不能很好的定植于小麦根部，故起到的防护作用不是很大。现在如果能够筛选出一种菌能够产生的胞外淀粉酶较多，能很好的利用小麦体内的营养，较为牢固的定植于小麦体内，那能够较为有效的抑制小麦的病虫害，为小麦的增产有很大的作用。 1.4 0-9菌株 蜡样芽孢杆菌，革兰阳性杆菌，大小为0.9-1.2m1.8-4.0m，两端钝园，一般从短链到长链，培养6h后即可形成芽胞，芽胞位于菌体中央，椭圆形，不膨出。周生鞭毛。能运动。无荚膜。生长时需氧或兼性厌氧，在普通琼脂培养基中生长旺盛，形成较大、灰白色、表面粗糙似融蜡状菌落，因此而得名；在复杂培养基中能呈厌氧生长，葡萄糖和硝酸盐可促进厌氧生长；生长温度范围为5-30，10以下停止繁殖。其繁殖体不耐热，100经20min可被杀死。最适生长温度为28-35，生长酸碱度范围为ph4.3-9.0，生长最低水分活度为0.95。发酵葡萄糖，产酸并产气。 蜡样芽孢杆菌0-9菌株是1株从健康小麦植株中分离获得的有益芽孢杆菌，为小麦内生细菌，属革兰氏阳性蜡样芽胞杆菌，运动性强，具有产生葡聚糖酶、几丁质酶和蛋白酶等真菌细胞壁降解酶和铁载体的能力。该细菌对小麦纹枯病病原菌有抑制作用，抑菌率50%70%，实验室条件下防治效果高达82.86 %。 利用生防菌株0-9抗利福平（rifampicin，rif）标记法，得到300株抗rif菌株。随机选取其中9株，通过形态学观察、革兰氏染色、芽孢染色、产酶能力、运动性、拮抗作用及耐盐性测试等实验，证实这些抗药标记菌株为0-9的衍生菌株，并保持对小麦纹枯病的防治效果。1.5 研究背景及意义芽孢杆菌对马铃薯疮痂病、苹果红癌病、赤霉病等许多土传病害以及地上部病害具有生防的效果。用于生防的芽孢杆菌种类有枯草芽孢杆菌(b.subtilies) 、多粘芽孢杆菌( b. polymyxa) 、蜡状芽孢杆菌( b.acillus cereus) 、蕈状菌变种( b.cereus varm ycoides)等。随着枯草芽孢杆菌作为革兰氏阳性代表菌株基因组被测序以来，同枯草芽孢杆菌有关的研究，特别是有关生化分析、分子生物学等方面基础理论研究持续展开。当今人们的环保意识在不断的增强，生物农药正在引起越来越多的关注。芽孢杆菌杀菌剂克服了传统化学农药污染环境、危害人畜、易产生抗性等缺点，具有选择性强、安全、原料简单等优点，在微生物杀菌剂市场中初露头角。很多优良的枯草芽孢杆菌菌株已经应用于生产实践。在生防应用中，让菌体能很好定植是一个很重要的问题。但是菌体由于营养的限制总是不能再植物体内形成优势菌株，不能对植物形成有效的保护伞。那么我们的迫切要求改良菌种的遗传物质，使其能够很好的利用植物体内的营养物质生存。碳源是限制菌种生存的主要原因，如能够将0-9菌株遗传物质改良为能够很好利用小麦淀粉的菌，那么会对小麦生物防治病虫害有良好的效果。2 材料与方法2.1 供试材料2.2.1 供试菌株菌种0-9。由河南大学实验室从健康小麦体内分离得到，0-9为蜡样芽孢杆菌。菌株保存于-70 超低温冰箱。2.1.2 培养基lb培养基：蛋白胨 10.0g，酵母提取物 5g，nacl10.0 g，蒸馏水1000ml，ph7.0。一部分加入2%（w/w）琼脂用来制备固体lb培养基，另一部分制备液体lb培养基。灭菌条件：121 、0.11mpa灭菌20min。淀粉培养基：可溶性淀粉 5.0g,加热至淀粉溶解，蛋白胨 10.0g,牛肉膏 3.0g,定容至1000 ml，ph7.0，加入2%（w/w）琼脂制备固体淀粉培养基。灭菌条件：121 、0.11mpa灭菌20min。2.1.3 所用试剂 （1） 卢戈氏碘液 碘化钾 0.4g 碘片0.2g 蒸馏水 60ml（2） 红霉素 （3） 卡那霉素2.1.3实验器材小试管 ep管 水浴箱 平皿 枪头 摇床 滴管 牙签 涂布棒 接种环 2.2 实验方法2.2.1 菌株活化 配制lb液体培养基，灭菌三角瓶，200 ml lb液体培养基中接入取-70冰箱中保存的0-9 20l，放入摇床，30 200rpm下培养24h。2.2.2菌株转座 配制lb固体培养基，倒平板。用无菌水稀释菌悬液至10-5、10-6浓度。吸取2 ml 10-6浓度的菌悬液涂布到平板上，一定要涂布均匀。将培养箱升温至46，将倒好的平板放入培养箱转座10小时。 2.2.3菌种转接 配制lb固体培养基，100 ml培养基中加入卡那霉素50l，另外100 ml培养基中加入红霉素20l，分别摇匀，倒平板，分别标明erm1-5、kan1-5。用灭菌好的牙签挑取单菌落，先在红霉素的平板上接种，然后在卡那霉素的平板上的相应位置接种。将接种好的平板放入30的培养箱中培养36小时。将培养好的菌放入超净台，挑取在加红霉素板上长而在加卡那霉素板上没有长的菌落，接种到新的板上。同样是先点种红霉素板，再点种卡那霉素板，放入30的培养箱中培养36小时。 2.2.4菌种保存 配制lb液体培养基，分装到大试管中，每个试管5ml。用灭好菌的枪头挑取在加卡那霉素板上长而在加红霉素的板上不长的菌株，接种到试管中，放入摇床，30 200rpm下培养24h。ep管中加700l 50%的甘油，再吸取700l菌悬液加到管中，摇匀。编号，保存至-70冰箱。2.2.5菌种活化配制lb液体培养基，灭过小试管，每个瓶中加入2 ml lb液体培养基，接入20l保藏的菌株，放入摇床，30 200rpm下培养24h。2.2.6菌悬液的浓度的调节配制lb液体培养基，灭过三角瓶，每个瓶中加入100 ml lb液体培养基，接入1ml已活化的菌悬液，放入摇床，30 200rpm下培养24h。 首先测量每个菌的od值，用灭过菌的lb培养基稀释调节至各个菌的od值至相同。配制淀粉固体培养基，倒平板。2.2.7菌株的初筛配制淀粉固体培养基，倒平板。用枪头吸取2l已调好相同浓度的菌悬液点种到平板上，一个平板点种7个菌，每个菌重复三次，将点种好的平板放入30的培养箱培养24h。将培养好的平板中滴加卢戈氏碘液，染色。并量取不同菌落的透明圈的大小。 2.2.8菌株的复筛为保证目标菌株的培养条件相同，将疑似菌株点种到同一个平板上，将点种好的平板放入30的培养箱培养24h。将培养好的平板中滴加卢戈氏碘液，染色。并量取不同菌落的透明圈的大小。 3结果现象与分析3.1菌落染色结果转座得到100个突变体，编号从1至100。0-9、 1-100号菌株培养24h后，对其进行碘液染色。结果显示，0-9和36、38、56、94号菌的透明圈出现较大差异（表1图：1 ）。菌株0-9在培养24h后形成的透明圈直径大小为14.5mm，菌株36、38、56、94形成的透明圈直径大小分别为20.7mm、19.2mm、9.0mm、9.6mm。表1 0-9菌株与目标菌株透明圈直径菌号透明圈直径大小（mm）现象重复1重复2重复3平均值0-913.315.614.614.5透明圈直径大小适中3621.120.920.320.7透明圈直径比对照菌大的多3818.617.320.719.2透明圈直径比对照菌大的多568.211.47.39.0透明圈直径比对照菌小的多949.28.710.99.6透明圈直径比对照菌小的多透明圈直径（mm）图1 36、38、56、94与0-9菌株透明圈直径3.2结果分析3.2.1 胞外淀粉酶产生腊状芽孢杆菌0-9是从一株健康小麦植株中分离获得的有益芽孢杆菌，为小麦内生细菌，产生的胞外淀粉酶能够将小麦体内的淀粉分解为菌体能更好利用的物质（如：麦芽糖）。调控0-9菌分泌胞外淀粉酶的基因位于菌体的结构基因中。从实验的36、38号菌来看，它们的透明圈直径都远大于对照组0-9号菌株的透明圈直径。调控分泌胞外淀粉酶的基因遭到破坏之后可能导致产生的淀粉酶的量更大，但从56、94号菌来看，它们透明圈的直径又小与对照组0-9的透明圈直径。这说明基因被插入的位置不同也可能导致胞外淀粉酶的合成能力或者是分泌能力下降，最终导致产生的淀粉酶的量较对照组小。因此，在细菌分泌胞外淀粉酶的量和多个因素有关。最主要的是芽孢杆菌内部的基因调控。淀粉酶基因本身的表达能力受到多个基因的调控，基因内部的调控基因、启动子受到破坏或者是被外源基因插入后都会导致淀粉酶产生的多少受到影响。芽孢杆菌膜系统的分泌能力和淀粉酶的运输能力都与最终检测到的透明圈直径的大小有关。3.2.2 原因分析36、38、56、94号菌株由0-9转座而来，36、38号菌产生的胞外淀粉酶的量远大于对照组的产生量，56、94号菌产生的胞外淀粉酶的量远小于对照组的产生量可能的原因如下：（1）36、38号菌由于转座的基因强化了淀粉酶基因的启动子，使淀粉酶的转录与翻译量增加。转座的基因插入到控制芽孢杆菌膜系统合成的基因中，导致芽孢杆菌合成的膜为不完整或者是通透性比较大的膜，从而导致分泌的淀粉酶量较多。转座的基因插入到编码运输淀粉酶到膜外载体的基因中，导致载体的量增加或者运输能力增强，从而使胞外淀粉酶的量增加。（2）56、94号菌由于转座的基因若化了淀粉酶基因的启动子，使淀粉酶的转录与翻译量减小。转座的基因插入到控制芽孢杆菌膜系统合成的基因中，导致芽孢杆菌合成的膜通透性更小，从而导致分泌的淀粉酶量较少。转座的基因插入到编码运输淀粉酶到膜外载体的基因中，导致载体的量减小或者运输能力减弱，从而使胞外淀粉酶的量降低。 （3）操作方面：由于各个菌株数目较多，不是同一批活化并测量，由于个人或者天气的原因，导致菌生长不是在恒定的条件下进行，从而导致菌的胞外淀粉酶的产生能力有差异。 3.2.3重复不一致的原因分析 每个菌株的两个重复实验的数据均有所差异，分析原因，可能有：（1）由于菌悬液的差异会导致不一致。因为枪头的原因会导致点种时量不一定完全相同，od值虽然相同，但是菌悬液的浓度还是会有一定的差异，从而导致接种的菌量有差异。（2）平板培养时使用的平板不同，透气性能可能有所不同，影响到菌体生长。（3）平板中的培养基的厚度不同，导致重复的结果有差异。（4）由于个人原因量取透明圈的大小时有差异。4讨论4.1菌种活化与三角瓶培养的作用 菌株在冷冻保藏条件下处于休眠状态，接种前需进行活化培养，使其恢复最佳生长状态，生理状态水平达到稳定。本实验要求每个菌株在点种到平板培养之前，各个的菌体数量、生理状态水平一致，因此在试管培养活化菌株后，需要在试管中培养一定的时间。为确保实验数据的准确性，需通过测od值等方法使菌液浓度尽量达到一致。4.2透明圈大小和外界各方面因素的关系（1）接种量：接种量大小对菌株生长及淀粉酶分泌有一定影响, 接种量大会导致菌体的生长旺盛，生长产生的菌落较大，从而影响到淀粉酶透明圈的大小。（2）培养基浓度：培养基的浓度较小时，会导致淀粉酶在菌落周围扩散较快，从而产生的透明圈较大，否则将会透明圈直径较小。（3）培养基组成对胞外淀粉酶分泌的影响：在培养基成分中, ph值、温度、离子强度等因素影响菌体膜的流动性及通透性，从而影响淀粉酶的分泌量。培养基中mg+培养的浓度会影响到运输淀粉酶的分泌的速度，进而影响透明圈的大小。4.3 实验缺陷及改进 （1）只从碘液染色发来度量菌体产生胞外淀粉酶的能力的方法有缺陷，因为透明圈的大小与很多因素有关，复筛应该用3,5-二硝基水杨酸显色法12的方法来再次验证。 （2）最后淀粉酶的量的多少不能简单的通过透明圈的直径大小本相对证明菌产生淀粉酶的能力大小，而应该通过将其产生的淀粉酶提取，测其酶活力，这样会更有说服力。 （3）本实验只研究了不同菌体突变体产生淀粉酶的能力差异，还应该考虑到同一菌株不同的培养条件（如：通气量、温度、ph、离子强度等）对其产生淀粉酶量的影响。4.4 实验注意事项（1） 转座时需要预先将培养箱升温至46，否则将会影响到转座的效果。（2） 菌株保存时一定要摇匀，否则影响保存效果。（3） 转座涂布时一定到涂布均匀，培养基厚度应该较薄，否则将会出现的单菌落较少。（4） 倒固体lb培养基时要避免平板上出现气泡，否则将会影响到点种的观察。（5） 点种菌时要注意位置一定要对应好。（6） 一定要先点种红霉素平板再点种卡那霉素平板，否则将会出现假阳性菌株。4.5 实验展望将分离到的四种菌分别侵染到小麦体内，对小麦的敌抗病虫害能力进行测定，胞外淀粉酶的分泌能力与生防的作用还有待确定，因此应开展生防实验13，探求植物量与所需淀粉酶的关系，病虫害的类型与淀粉酶分泌多少的相关关系。参考文献1 张炳欣, 张平, 陈晓斌, 等. 影响引入微生物根部定殖的因素 j.应用生态学报, 2001, 11 (6): 951953.2 刘建国, 裴炎, 丛威, 等. 蜡状芽孢杆菌s1 发酵条件的研究 j.工业微生物, 2001, 31 (1): 47.3 焦文沁. 蜡样芽孢杆菌a-47 增效因子的筛选及增效机制初探 d.北京: 中国农业大学, 2005.4 王东明. 蜡样芽孢杆菌6371 的多效性及发酵条件的研究 d. 南京: 南京师范大学, 2004.5 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