生物科学毕业设计.doc

滨州学院本科毕业设计(论文)滨州学院毕业设计（论文）题 目农杆菌介导f3h基因对矮牵牛的遗传转化系 （院）生命科学系专 业生物科学班 级2007级1班学生姓名张春艳学 号2007120324指导教师刘南南职 称讲师二一一年六月十日10独 创 声 明本人郑重声明：所呈交的毕业设计(论文)，是本人在指导老师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，成果不存在知识产权争议。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，本设计（论文）不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明。本声明的法律后果由本人承担。作者签名: 二 年 月 日毕业设计（论文）使用授权声明本人完全了解滨州学院关于收集、保存、使用毕业设计（论文）的规定。本人愿意按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版，同意学校保存学位论文的印刷本和电子版，或采用影印、数字化或其它复制手段保存设计（论文）；同意学校在不以营利为目的的前提下，建立目录检索与阅览服务系统，公布设计（论文）的部分或全部内容，允许他人依法合理使用。（保密论文在解密后遵守此规定）作者签名: 二 年 月 日农杆菌介导f3h基因对矮牵牛的遗传转化摘 要本研究利用矮牵牛叶片作为愈伤组织诱导和转化的材料，通过对农杆菌介导梦幻系列矮牵牛的遗传转化体系的探索，将f3h基因导入矮牵牛中，获得抗性植株，为通过基因工程手段进行矮牵牛的遗传改良奠定基础。关键词：矮牵牛；f3h基因；根癌农杆菌；遗传转化agrobacterium-mediated f3 h genes transformation on petunia geneticsabstractin this study，by using petunialeaf as the material of callus inductionand transformation and studying on agrobacterium-mediated transformation system for petunia dream hybrida, f3h gene was transferd into the petunia to obtainresistant plants，which laid the foundation for the genetic improvement ofpetunia through the means of genetic engineering.key words：petunia；f3h gene; agrobacterium tumefaciens；genetic transformation 滨州学院本科毕业设计（论文）目 录引言1第一章 材料与方法21.1材料21.1.1植物材料21.1.2农杆菌菌株和质粒21.1.3试剂21.1.4主要仪器设备31.1.5培养基31.2方法31.2.1无菌苗的获得31.2.2 叶片的消毒处理31.2.3愈伤组织和不定芽的诱导41.2.4生根诱导41.2.5 抗生素敏感性试验41.2.6 转化受体预处理41.2.7 农杆菌活化41.2.8 侵染41.2.9 共培养41.2.10 除菌51.2.11 分化筛选和抗性植株的获得5第二章 结果与分析52.1不同处理时间的消毒效果52.2 愈伤组织诱导和不定芽分化的连续性52.3 潮霉素对不定芽诱导和分化的影响62.4 菌液浓度对转化的影响62.5 乙酰丁香酮对转化的影响72.6 抗性植株的获得8结论9参考文献10谢辞11引言通过分子生物技术将外源基因导入植物体中，获得一些品质优良、抗除草剂、抗病虫害的转基因植株，已经是现今作物育种的趋势。自80年代初美国首次培育出抗卡那霉素的烟草植物以来，随着基因工程技术的不断完善，许多农作物的转基因研究有了重大突破，观赏植物基因工程也随之迅速发展。florigene 公司和suntory公司向缺失dfr 的白色香石竹中导入矮牵牛f35h 和dfr 基因，成功得到紫色转基因植株；向含有天竺葵色素和花青素的月季品种中引入f35h基因，使花色转变为蓝色；将龙胆中编码f35h 的基因转入烟草中，花色仅有略微的改变1。robinson等人（1993年）和zuke 等（1998年）分别利用反义技术将acc氧化酶或acc合成酶基因的反义序列导入香石竹中，获得的转基因切花寿命大大延长2。就其安全性而言，因为观赏植物仅供观赏而非食用，所以转基因观赏植物更容易实现商业化，显示出其特有的优越与潜力3。花的颜色是观赏植物的重要经济性状，花的颜色主要由三大类群色素决定4,5：类黄酮（flavonoids）、类胡萝卜素（carotenoids）和甜菜色素（betalains），其中，类黄酮中的花色素苷是合成途径及相关基因研究最为深入的色素。本实验中的目的基因二氢黄酮醇3羟化酶（f3 h）基因，其表达产物二氢黄酮醇3羟化酶属于细胞色素p450 单加氧酶（cyp450 s） ，在类黄酮途径中，分别羟基化柚皮苷和二氢山萘酚的b2环3位置形成圣草酚和双氢槲皮素，而它们是合成花色素和原花色素的重要前体物质6，因此二氢黄酮醇3羟化酶是类黄酮途径中的1 个关键酶，对花青素的合成起重要作用。f3h基因己在许多植物中发现，在金鱼草中仅有一种b-环羟化酶基因eosina，它控制二氢黄酮醇3位的羟化。在矮牵牛中，二氢黄酮醇3位的羟化在不同组织里分别由ht1和ht2基因控制。f3h突变通常导致花中积累花葵素，而抑制花青素的合成。由于花葵素比花青素颜色深，因而花冠更多地表现为橙色或红色。矮牵牛( petunia hybri da vilm)，又名碧冬茄，属于多年生草本植物。花大色彩鲜艳，花期长达数月，花语是喜悦、安心，是非常受欢迎的绿化植物。矮牵牛的常规繁殖采用播种或扦插，由于矮牵牛为异花授粉，种子繁殖容易发生分离变异，影响观赏效果；而扦插存在繁殖率低、种苗质量低等因素7。应用组织培养技术和转基因技术，不仅能在短期内生产出大量整齐、均匀的健壮种苗，而且可以培养出各种花色的植株。近年来，利用矮牵牛进行遗传学和基因功能组学研究成为热点8，但由于矮牵牛的再生和遗传转化的基因型依赖性很强，故不同的研究者得出的结论也不相同9 -11。本实验在前人12-14研究的基础上，通过对侵染菌液浓度等遗传转化条件的优化，初步建立了农杆菌介导的梦幻系列矮牵牛遗传转化体系，并将f3h基因导入矮牵牛中，获得抗性植株，为通过基因工程手段进行矮牵牛的遗传改良奠定基础。第一章 材料与方法1.1材料1.1.1植物材料植物材料为矮牵牛梦幻系列（dream，hybrids）粉红色大花品种的种子及校园花坛内矮牵牛梦幻系列植株，以叶片作为转化的受体材料。1.1.2农杆菌菌株和质粒农杆菌菌株为eha105，质粒为含有f3h基因的双元植物表达载体（图1）。图1. 用于遗传转化的植物表达载体1.1.3试剂ms培养基成分、yeb培养基成分、蔗糖、琼脂粉、hcl、nacl、乙醇、吐温、头孢噻肟钠、naa、6-ba、潮霉素等。1.1.4主要仪器设备高压蒸汽灭菌锅、数字酸度计、超纯水制造机、电子天平、超净工作台、恒温培养箱，恒温摇床。1.1.5培养基1) 农杆菌培养基yeb：tryptone 5g/l+yeast extract 5g/l+蔗糖 5g/l+mgso47h2o 2mmol/l，ph 7.02）种子成苗培养基：ms基本培养基+3%蔗糖+1.1%琼脂粉，ph5.83) 愈伤组织诱导及分化培养基：ms基本培养基+6-ba 1.0mg/l+naa 0.1mg/l+3%蔗糖+1.1%琼脂粉，ph5.84) 预培养培养基：同愈伤组织诱导及分化培养基。5) 共培养培养基：ms基本培养基+6-ba 1.0mg/l+naa 0.1mg/l+3%蔗糖+1.1%琼脂粉，ph5.26) 除菌培养基：ms基本培养基+6-ba 1.0mg/l+naa 0.1mg/l+头孢噻肟钠500mg/l+3%蔗糖，ph5.87) 分化筛选培养基：ms基本培养基+6-ba 1.0mg/l+naa 0.1mg/l+头孢噻肟钠 300mg/l +hyg 5mg/l +1.1%琼脂粉，ph 5.8。8）生根培养基：1/2ms基本培养基+ naa 0.5mg/l+3%蔗糖，ph5.81.2方法1.2.1无菌苗的获得将矮牵牛种子用75%乙醇浸泡消毒30s，再用84消毒液处理20分钟，其间不断摇动15，然后用无菌水冲洗35次，并用无菌滤纸吸干，接于种子成苗培养基中，在25，14h光照/天的培养箱中进行培养至无菌苗产生，其间换23次培养基。1.2.2 叶片的消毒处理将来自校园花坛内的幼嫩、厚实、肥壮的叶片用自来水清洗，75%乙醇浸泡消毒30s，再用加入两滴吐温的84消毒液处理1020分钟，最后用无菌水冲洗35次。1.2.3愈伤组织和不定芽的诱导将无菌苗的叶片及取自校园花坛消毒处理后的叶片在超净工作台上去掉中间叶脉，切成0.5cm2小块，接于愈伤组织诱导及分化培养基，于25，14h光照/天的培养箱中进行培养16。1.2.4生根诱导将分化出的丛生芽接种于生根培养基中生根成苗。1.2.5 抗生素敏感性试验 在愈伤组织诱导及分化培养基中添加不同浓度的潮霉素(0、2、5、10、15、20 mg/ l) ，接种叶片，观察培养过程中愈伤组织出现的时间和状态，10d后进行统计，确定抗生素致死浓度。1.2.6 转化受体预处理将叶片按1.2.3的操作接种在愈伤组织诱导及分化培养基上预培养2d，当叶片切口处刚刚开始膨大时进行侵染。1.2.7 农杆菌活化取-20保存的菌种，接种到添加硫酸链霉素50mgl的液体yeb培养基中，在恒温摇床上，于28、180rpm培养过夜。次日，按1：100比例，吸取1ml菌液至100ml yeb液体培养基中继续培养至od6000.4-1.0左右。1.2.8 侵染于超净工作台上，将经过预培养的叶片放入备好的菌液中，浸泡15min，期间摇动12次，使菌液与叶片充分接触，取出叶片置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。1.2.9 共培养将侵染过的叶片接种在共培养培养基上，在25培养条件下培养3d。1.2.10 除菌将经过共培养的叶片用无菌水冲洗35次，转入液体除菌培养基中，于150rpm，25振荡洗涤培养2h，其间换12次培养基，除菌后用无菌滤纸吸干叶片多余水分。1.2.11 分化筛选和抗性植株的获得 将除菌后的叶片转移到分化筛选培养基中，在25，14h光照/天的培养箱中进行培养，直至获得抗性芽。当抗性芽长至23cm后，转至生根培养基生根直到获得抗性植株。 第二章 结果与分析2.1不同处理时间的消毒效果实验中采用84消毒液对取自校园花坛的叶片进行消毒处理，发现不同的处理时间消毒的效果也不同。处理10分钟时污染率较高，多数叶片出现霉菌菌斑；处理20分钟叶片失绿严重；处理15分钟叶片基本无污染，也无失绿现象，效果最好。2.2 愈伤组织诱导和不定芽分化的连续性叶片接于愈伤组织诱导及分化培养基上，3d后开始弯曲，呈弓形翘起；7d后叶片肿大，并且在切口处有不同程度的膨大，可观察到从切口处形成浅绿色愈伤组织（图2），以后颜色转绿，并有绿色芽点出现；21d后不定芽形成（图3）；30d后丛生芽可长成幼小植株。在同一种培养基上，矮牵牛叶片可以完成愈伤组织诱导和不定芽形成两个不同阶段的培养，这种培养的连续性使实验周期大大缩短。图2. 愈伤组织的诱导图3. 丛生芽的形成2.3 潮霉素对不定芽诱导和分化的影响前人进行的矮牵牛遗传转化研究多用新霉素磷酸转移酶作为选择标记基因，用卡那霉素、新霉素或g418进行转化材料的筛选12。本研究使用潮霉素磷酸转移酶作为选择标记基因，用潮霉素进行转化材料的筛选，潮霉素对植株再生有很大的抑制作用，而确立适宜的使用浓度又是遗传转化体系建立过程中的重要步骤，因此，在进行遗传转化前先进行潮霉素敏感性实验是非常必要的。本实验设置了2、5、10、15、20 mg/l 5个潮霉素浓度梯度，发现与不添加潮霉素的对照相比，当潮霉素浓度为10mg/l以上时，叶片全部失绿、变白，无愈伤组织形成；当潮霉素浓度为2和5mg/l时，叶片部分失绿，14d后长出愈伤组织，28d后分化出不定芽，对愈伤组织的诱导和不定芽分化无影响。最后确定，5mg/l作为遗传转化过程中转化材料的潮霉素筛选浓度。2.4 菌液浓度对转化的影响农杆菌菌液浓度是影响转化的一个非常重要的因素，菌液浓度过低时，会由于农杆菌细胞数目不足使转化率降低；菌液浓度过高，则会产生某些有害代谢物对植物细胞造成伤害17。农杆菌浓度常用od600来表示，本实验采用od600 0.4、0.6、0.8、1.0四个梯度，以抗性叶片率作为调查指标（图4），探讨农杆菌菌液浓度对梦幻系列矮牵牛转化的影响，结果见表1。从表中可以看出，od600为0.6时转化率最高，菌液浓度继续加大，对叶片伤害大，且除菌难度加大，抗性叶片率降低。因此，以od6000.6作为转化菌液浓度。图4. 矮牵牛叶片的抗性筛选表1. 菌液浓度对矮牵牛转化的影响菌液浓度（od600）抗性叶片率（%）0.40.60.81.021.15（11/52）31.48（17/54）19.64（11/56）15.69（8/51）注：抗性叶片率=（抗性叶片数 / 转化叶片数）100%2.5 乙酰丁香酮对转化的影响 矮牵牛是双子叶植物，作为农杆菌的天然宿主，会自身产生促进vir基因活化的物质，因此，在矮牵牛的转化中可以不添加酚类化合物，在实际的转化研究中则结论不一12。本实验探讨了在共培养阶段添加或不添加促进vir基因活化的酚类物质乙酰丁香酮（浓度为100mol/l）对转化效率的影响，结果发现，在菌液浓度同为od600为0.6时，添加乙酰丁香酮后的抗性叶片率与未添加的相比无明显提高（表2）。表2. 乙酰丁香酮对矮牵牛转化的影响乙酰丁香酮抗性叶片率（%）0100mol/l28.30（15/53）29.82（17/57）2.6 抗性植株的获得 通过以上转化影响因素的探讨，优化了梦幻系列矮牵牛的转化体系（图5），按此体系将f3h基因导入矮牵牛中，获得抗性植株（图6）。种子 84消毒20min 接于成苗培养基上 校园花坛植株叶片 无菌苗叶片 84消毒15min接于愈伤组织诱导及不定芽分化培养基上预培养2d于od600为0.6的菌液中侵染15 min，共培养3d 除菌后接于分化筛选培养基中至抗性芽出现不定芽达到2cm高时，接于生根培养基生根壮苗获得抗性植株图5. 农杆菌介导法转化矮牵牛流程图图6. 矮牵牛抗性植株结 论通过不同浓度的植物激素配比预试验，发现当6-ba浓度为1.0mg/l、naa浓度为0.1 mg/l时，能使愈伤组织诱导和不定芽分化连续进行，不定芽得率高，且为丛生芽，缩短了组织培养的时间，建立了适合矮牵牛的再生体系。经过潮霉素敏感性实验，确定矮牵牛叶片转化后的最佳筛选浓度为5mg/l。通过对转化影响因素的探讨，优化了梦幻系列矮牵牛的转化体系，将f3h基因导入矮牵牛中，获得抗性植株，为通过基因工程手段进行矮牵牛的遗传改良奠定基础。参考文献1 司爱君, 祝建波, 李吉莲, 邓福军. f35h基因的克隆、表达载体构建与矮牵牛遗传转化j.西北农业学报, 2008,17(5):306-309,329.2 zukera, et al. genetic engineering for cut-flower improvement j. biotechnology advances，1998,16(l):33-79.3 周音,张智奇,殷丽青,张建军.观赏植物基因工程研究进展及存在问题j.上海农业学报,2000,16(1):90-96.4 m itchell k a , m arkharn 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