透射电镜样本的制备.ppt

透射电镜样本的制备,超薄切片制样 负染,超薄切片,由于电子的穿透能力弱，一般的组织细胞的切片，无法在电镜下获得清晰的图像。阻碍了电子显微镜的发展。 1957年，英国Huxley发明超薄切片机。,超薄切片制片过程,取材,取材具体方法,将动物麻醉或急性处死，暴露的所需脏器。 用锋利剪刀剪下一小块组织，放到滴有预冷固定液的蜡片上。 将组织切成细长条，再将其切成小块（1mm3）。 将小块移至装有预冷固定液的清洁小瓶内。 若组织块带有血液而使小瓶内固定液浑浊，应更换新鲜固定液，然后置于4冰箱内固定。,固定,目的：尽可能完整保存细胞在活体状态时的超微结构细节，避免自身酶的分解而出现自溶，或因外界微生物的侵入繁殖而产生腐败，致使细胞的超微结构遭受破坏。同时使细胞内的各种成分固定下来，避免在以后的冲洗和脱水时溶解和流失。,固定方法,化学固定：浸泡固定，原位固定，灌注固定 物理固定：冷冻固定，微波固定，临界点干燥固定,灌注固定,通过血液循环的途径将醛类固定液灌流到所要男友定的组织中，待组织适度硬化后，切取所需组织。此法固定迅速而均匀，可同时保存酶的活性和组织超微结构。 适用于取材柔软组织或难以浸透、死后变化快的组织和器官，如对中枢神经系统、视网膜和肾脏等组织的固定。,理想固定剂,常用固定剂,固定方法戊二醛-锇酸双固定,先用2.5%戊二醛固定2h以上。 缓冲液多次清洗（pH7.4 0.2mol/L磷酸缓冲液洗三次，15min/次）。 1%锇酸固定2h。,清洗,组织在固定后，应用清洗液洗去残留的固定液 残留的醛可与锇酸反应产物细的电子致密的还原锇。 锇酸可与乙醇作用生成沉淀。 清洗液采用与固定液同系列的缓冲液。（磷酸缓冲液，二甲砷酸钠缓冲液）,脱水,去除样品中的水，为包埋剂的均匀浸透做准备,常用脱水剂,乙醇，与环氧树脂的互溶性差，需用环氧丙烷作为 中间溶剂进行转换。 丙酮,市售的无水丙酮含少量水分，可加入 无水硫酸钠或硫酸铜等干燥剂吸去水分。,脱水,浸透和包埋,通过脱水剂稀释包埋剂，最终让包埋剂逐渐取代脱水剂，使其渗透到组织细胞中去 以包埋剂完全浸透到组织内部，经加温逐渐聚合成坚硬的固体，成为细胞结构的支架，能够承受切片时的各种力的作用，有利于超薄切片。,理想包埋剂,Epon812：环氧树脂包埋剂。淡黄色液体，黏度较低，易渗入组织，对细胞结构保存好，在配制时需充分搅拌。聚合后成为具有稳定三维空间结构的固体。,包埋剂配方,包埋板,切片,修块 切片,超薄切片机,机械推进式：通过微动螺悬及微动杠杆使标本臂向刀刃作微小推进。 热胀冷缩式推进：利用机内金属杆在加热或冷却的微小变化来推进。,判断切片厚度：利用切片反射的光和从切片下水面反射光发生干涉，不同厚度切片在显微镜下呈现不同的干涉色，干涉色与切厚度的关系是：,Formvar膜制备,Formvar（PVF）溶于纯二氯乙烯制成0.2-0.5%的制膜液,染色,组织细胞的成分主要由碳、氢、氧、氮等低原子序数的元素组成，不能形成足够的反差。 利用重金属离子对不同细胞结构的结合能力不同，使各细胞结构对电子产生不同散射程 度以增强反差。,染色剂,30min左右,与CO2接触会形成不溶性碳酸铅沉淀 10min左右,半薄切片制作,可进行定位，克服超薄切片盲目性，提高电镜观察的效果。 修块时，将切片修得大一些，切成1m的厚片，甲苯胺蓝染色观察。,超薄切片制样程序,取材：处死实验动物后半分钟到1分钟内，最多15分钟取出1mm3的组织块 固定：,脱水：,浸透：,包埋：,超薄切片：包埋块修整成四边光滑尖端呈梯形面的锥体，切成50-70nm的超薄切片。 切片染色：,负染,阴性染色，是相对于普通染色（称正染色）而言。首先由hall在1955年提出。 Hall在病毒研究中用磷钨酸染色后，发现图像的背景很暗，而病毒象一个亮晶的“空洞“被清楚地显示出来。在超薄切片的染色中，染色后的样品电子密度因染色而被加强，在图像中呈现黑色。而背景因未被染色而呈光亮，这种染色称为正染色。而负染色则相反，由于染液中某些电子密度高的物质(如重金属盐等)“包埋“低电子密度的样品，结果在图像中背景是黑暗的，而样品像“透明“地光亮。两者之间的反差正好相反，故称为负染色,负染,简单快速 可显示生物大分子、细菌、分离的细胞器以及蛋白晶体等样品的形态、结构、大小及表面结构的特征。 病毒,负染染色剂的条件,较强的电子散射能力以产生足够的图像反差。 熔点高，在电子束的轰击下不会升华 溶解度大，不易析出沉淀。 在电镜下不呈现可观察到的结构。 分子小，容易渗入不规则表的凹陷处 与样品不起化学反应。 目前常用的负染液：磷钨酸，磷钨酸钾，磷钨酸钠。磷钨酸、磷钨酸钠、磷钨酸钾溶液通常用双蒸水或磷酸缓冲液配制成13的溶液，使用时应用1 molL氢氧化钠溶液将负染色液的pH值调至6.47.0或实验所需的值。,样品要求,样品要适当提纯。不要求样品悬液的纯度很高，但杂质过多，如大量的细胞碎片，培养基残渣，糖类及各种盐类结晶的存在会干扰染色反应和电镜的观察。 样品悬液浓度适中，太稀不易找到样品，太浓样品堆积影响观察。,负染染色方法,悬滴法：悬滴法 用一根细滴吸管吸一滴样品悬液滴在有膜的铜网上，滴样时要防止铜网被液体吸到管上来或翻转而被污染。滴液后静置数分钟，然后用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体，滴上负染色液，染色12分钟用滤纸吸去负染色液，再用蒸馏水滴在铜网上洗12次，用滤纸吸去水，待干后可用于电镜观察。,喷雾法： 将染色液和悬液样品等量混合，用特制的喷雾器喷到有膜的铜网上，待干后可用于电镜观察。喷雾法的优点是雾滴较小，分布均匀，不易凝结成块。但操作较麻烦，溶液混合时易产生沉淀，并且需要耗费较多的样品和染色液，尤其