总RNA的提取和RT-PCRPPT课件.ppt

实 验 总RNA的提取与RT-PCR,南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心 /sfzx/,.,完整RNA的提取和纯化,是进行RNA 方面的研究工作如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。 掌握从细胞中提取总RNA的方法 掌握RT-PCR基因扩增的原理和操作方法,目 的,实 验 流 程,提取原理 操作步骤,逆转录原理 操作步骤,提 取 总RNA,合成cDNA 第一链,PCR,电泳原理 电泳步骤,电 泳,第一部分 细胞总RNA的提取,操作步骤,1.匀浆化作用 8000rpm 离心2min收集细胞，弃上清；加入500uL的TRIpure,用振荡器震荡至无明显沉淀,室温静置5min. 2. 分离阶段 向匀浆样品中加入0.1mL氯仿，剧烈震荡15s，室温下孵育2-3min，12000g离心15min，吸取上清至新Ep管。 3. RNA的沉淀 向上清中加入0.5mL异丙醇，上下颠倒混匀,室温孵育10min， 12000g离心10min，弃去上清液，可见胶状沉淀。 4. RNA的漂洗 加500微升75乙醇洗涤沉淀一次，轻轻上下颠倒洗涤， 12000g离心5min,弃去乙醇. 5. RNA的再溶解 空气干燥RNA沉淀，注意不要完全干燥，加入10uL RNase-Free处理水，充分溶解。,原 理,10-5mg RNA/细胞 mRNA 3端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA) 结构，可用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。 RNA分离的方法：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。 目前常用的是Trizol法。,原 理：Trizol的主要成分,Trizol 是一种新型总 RNA 抽提试剂 主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白/核酸物质解聚得到释放。 酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。,在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在上层水相中。 取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。,原 理,仪器和主要试剂,1. 微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管 2. TRIpure试剂 3. 氯仿 4. 异丙醇 5. 75乙醇 6. 无RNase的水(溶液均需用DEPC处理过的水配制),所有的提取过程中都有五个关键点： 样品细胞或组织的有效破碎； 有效地使核蛋白复合体变性； 对内源酶的有效抑制； 有效地将从和蛋白混合物中分离； 对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。,关 键 点,RNA酶污染来源,RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。 严格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂的污染。 最大限度地抑制内源性的RNA酶：而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。,防止RNA酶污染的措施,所有的玻璃器皿均应在使用前于180的高温下干烤6h或更长时间。 塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高压灭菌。 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。 配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC在37处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经滤膜过滤除菌。 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。,RNA完整性检测,完整的RNA的电泳可明显地观察到28S和18S两条带，并且28S大约是18S的两倍宽。 若两条带不明显, 则说明RNA部分降解,可能的原因是污染了RNase。,RNA降解 A.组织取出后没有马上处理或冷冻。 B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70，而保存在了-5至-20。 C.细胞在用胰酶处理时过度。 D.溶液或离心管未经RNase去除处理。 E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5 。 DNA污染 A.样品匀浆时加的试剂量太少 B.样品中含有有机溶剂(如乙醇，DMSO等)，强缓冲液或碱性溶液,常见问题分析,第二部分 逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR),仪器和主要试剂,基因扩增仪、微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管 总RNA 第一链cDNA合成试剂盒 （含有逆转录酶、RNA酶抑制剂、缓冲液） dNTP mix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2 mmol/L Taq DNA聚合酶,操作步骤,采用TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit 合成cDNA第一链 按下列组分配制RT反应液 RT-Mix （包括反转录酶和反应缓冲液） 2.5 uL 引物（包括Oligo dT Primer ，50uM ； Random 6mers ,100uM ) 2.5 uL Total RNA 5 uL 反转录反应条件如下 37 15min （反转录反应） 85 5sec （反转录酶失活反应） 注：反转录步骤在PCR仪中进行,取0.2 ml PCR反应管一只，用微量加样枪分别加入各试剂：,PCR反应体系,rTaq Mix 25uL cDNA 第一链产物 5uL 引物（正、反向引物各10uM) 各 2uL H2O up to 50ul PCR反应条件如下 94 2min; 94 30sec; 55 30sec；72 30min-30循环 72 7min 4 保温,提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。 RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。 该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。,原 理,RT-PCR-逆转录-聚合酶链反应,逆转录酶,聚合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR扩增,鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37。在长时间的逆转录过程中，不会造成模板的降解，获得cDNA的几率大，适用于较长的cDNA链的合成。 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42。 Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。 MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScript。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。,反转录酶的选择,随机六聚体引物：用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。 特异性引物：是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。,引物的选择,PCR 反应系统的组成,模板 引物 dNTP 耐热的 DNA聚合酶（Taq酶） 缓冲液,（一）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,(二)引物 引物的设计：使用引物设计软件NTI 9.0,PRIME 5.0等 长度一般最低不少于16个核苷酸，而最高不超过30个核苷酸，最佳长度为1821个核苷酸。有时可在5端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点等，以完成基因克隆和其它特殊需要。 两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3端，即使无法避免，其3端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”（Primer dimer）。 引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构（hairpin structures）。 (G+C）%含量:引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（G+C）%含量应尽量相似。 引物的合成：找专门的生物公司进行引物合成,引物的特异性： 引物的设计与合成对 PCR 的成功与否起着决定性的作用 引物的浓度： 引物量太低，则产物量降低，会出现假阴性 引物浓度过高会促进引物的错误引导非特异产物合成，还会增加引物二聚体的形成 一般认为 PCR 反应中引物的终浓度为 0.2 1mol/l 为宜,（三）Taq 酶 从水生栖热菌 Thermus Aquaticus （ Taq ）中分离出的热稳定性 DNA 聚合酶 酶浓度：酶的浓度太低会使扩增产物产量降低，如果酶的浓度太高则会出现非特异性扩增 每 100l 反应液中含 1-2.5u Taq DNA 聚合酶为佳 保存：-20 ，避免反复冻存,本实验所扩增的产物DNA片段长度300bp400bp, 可取5lPCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。利用标准DNA-marker评估扩增的特异性。,琼脂糖凝胶电泳,实验材料,电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；二甲苯晴呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。 染料：Gelview、EB 电泳缓冲液：TBE 琼脂糖 DNA Marker 5000,溴化乙锭(EB) :3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，可与DNA结合,在紫外光照射下呈现红橙荧光,有致癌性. Gelview: 是一种新型核酸染料,可与DNA分子形成复合物，能产生极强的荧光信号，其灵敏度比EB高, 且荧光强度与DNA含量成正比荧光,在紫外光照射下呈现绿色荧光.,常用染料,实验材料,含有分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。 应选择在目标片段大小附近ladder较密的marker，这样对目标片段大小的估计较准确。,DNA Marker,实验材料,凝胶准备,胶床准备,