肺结核诊断新技术.ppt

结核病诊断新技术及其评价,宝鸡市人民医院呼吸科 魏胜全,内容,二、生化检测,三、细胞免疫学检测,一、微生物学检测,四、分子生物学检测,呼吸医生的尴尬？,先抗炎？ 再抗痨？ 实在不行，上化疗？,你懂的！ TB 的诊断有时有多难！病原学检测是诊断 TB 最重要的依据， 但据 2013 年 WHO 统计， 仅有 58% 的 TB 患者有病原学依据。,前言,早期准确诊断是结核病 (TB) 患者得以及时治疗的关键。 目前的 TB 诊断水平仍然薄弱。据世界卫生组织 (WHO) 估算， 2012 年的 860 万新发 TB 患者中，仅登记了 570 万，还有 217.5 万 (25.3%) 未被发现 (漏诊)。 提高诊断技术则是发现患者，减少误诊、漏诊的核心。,2019/8/12,一 、微生物学检测,包括涂片染色镜检、结核分枝杆菌 (MTB) 分离培养、 MTB 药敏和菌种鉴定等。 染色涂片法是临床上最便捷快速的诊断方法，但敏感度偏低，发达国家可检出 50% 的活动性肺结核，我国检出率一般约为 30%， 且无法区别非 MTB( Mycobacterium tuberculosis )。 MTB 分离培养是确诊 TB 最重要的依据，不仅能取得病原学结果，还能进一步进行药敏检测，指导治疗。 目前常用的细菌培养基包括 Lowenstein-Jensen 固相培养基 (L-J 法) 和 Middlebrook 7H9 7H11 液体培养基。固相培养基价格低，但耗时长，需要 48 周取得结果，加上菌种鉴定的时间耗时更长。基于 BACTEC MGIT 960、 BacT/Alert 3D 系统的液体培养基检测速度有明显提高 (14 周)， 但费用较高。,一 、微生物学检测,1.1 MTB 快速培养法 BACTEC MGIT 960 系统采用荧光增强原理，在培养管底部包埋对氧气浓度高度敏感的指示剂，通过检测氧气浓度变化以监测培养管内 MTB 的生长状态。阳性标本检出时间相对较短，平均为 9 d， 后续菌种鉴定及药敏试验时间平均为 4 d。 BACTEC MGIT 960 系统为目前国际通行培养标准，培养阳性率较固体培养法高出 10% 左右，检测界限 10 个菌落形成单位 (CFU)/mL。 BacT/Alert 3D 系统采用比色法原理，通过监测预处理标本中产生 CO2 与标本瓶中初始的 CO2 相比较，判断是否存在 MTB 生长。同时可以进行药敏检测。理论上培养速度较 L-J 法和 BACTEC MGIT 960 系统更快 (622 d)。 1.2 直接显微镜检技术 (MODS) 工作原理依据于 MTB 在液体培养基中生长会出现特征性的索状结构，该结构可以通过倒置显微镜观察到。 检测呼吸道标本中是否存在 MTB 的敏感度为 97.5%， 特异度为 94.4%， 出现阳性结果的中位时间约为 8 d 该方法无需昂贵的设备，简单，相对快速。,二、生化检测,TB 的生化检测主要包括腺苷脱氨酶 (ADA)、 乳酸脱氢酶 (LDH)、 血管紧张素转化酶 (ACE) 等酶学检测。此类方法简单快速，适用于 TB 早期诊断及鉴别诊断，但由于缺少结核特异性的酶标而无确诊价值。 2.1 ADA ADA 是嘌呤核苷代谢中重要的酶。胸 (腹) 腔积液 ADA 检测对结核性胸 (腹) 膜炎鉴别诊断有重要意义，胸 (腹) 腔积液 ADA 浓度以 45U/L 为界，结核性大多超过此值，特异度及敏感度超过 80%。 胸 (腹) 腔积液 ADA 与血清 ADA 比值 1 更倾向结核性积液。而对于癌性及非特异性积液，其比值一般 8U/L，而后两者一般正常， ADA 浓度 8U/L。 结核性脑膜炎 表明，将 ADA 浓度 8U/L 作为结核性脑膜炎诊断的阈值时，其诊断的总敏感度 96%。,二、生化检测,2.2 LDH 是一种糖酵解酶，几乎存在于机体所有组织细胞的胞质内。对 TB 的诊断来说， LDH 可用于区别渗出性积液与漏出性积液，胸 (腹) 腔积液 LDH 与血清 LDH 比值 0.6， LDH 浓度 200U/L 倾向渗出液。结核性胸 (腹) 腔积液的 LDH 浓度一般 200U/L， 与癌性胸 (腹) 腔积液 LDH 浓度变化无特征性差异。 2.3 ACE 为二肽羧肽水解酶，又名激肽酶 I， 存在于肺、肾、脑、小肠、胎盘等组织的血管内皮细胞或上皮细胞及血浆。对 TB 的诊断来说，血清 ACE 的检测主要用于 TB 与结节病的鉴别，后者血清 ACE 浓度升高多见。结核性胸腔积液 ACE 浓度一般不升高，胸腔积液 ACE 与血清 ACE 比值 1 更倾向结核性积液，而恶性积液的比值多 1。,三、细胞免疫学检测,MTB 为胞内致病菌，因此普遍认为 TB 的发病过程中细胞免疫占主导地位。细胞免疫学诊断主要包括结核菌素皮肤试验 (tuberculin skin test， TST) 和 - 干扰素释放试验 (interferon gamma releaseassay， IGRA)， 而结合上述两种方法优点的改良结核菌素皮肤试验近年来发展很快。 3.1 TST 即 PPD 皮试或皮内 Mantoux 试验。 TST 从 1890 年发明以来沿用至今。由于 TST 存在假阳性结果和假阳性结果，影响了其使用价值。假阳性结果大部分是由于结核菌素抗原与其他分枝杆菌有交叉抗原所致。这种交叉抗原反应来自潜在的非 MTB 感染或接种卡介苗引起的反应。假阴性结果有很多潜在的原因，迟发超敏反应低下常见于免疫受损者，包括人免疫缺陷病毒 (HIV) 感染，长期使用激素等情况。阴性结果不能排除 MTB 感染。由于不同地区的感染背景差异较大以及没有潜伏性结核感染 (LTBI) 的检测金标准，导致 TST 的敏感度和特异度不能准确评价。,三、细胞免疫学检测,3.2 血清学检测 WHO 和不少国家推荐使用 IGRA( interferon gamma release assay) 进行 MTB 感染的血清学检测，这类试验采用酶联免疫吸附试验 (ELISA) 和 (或) 酶联免疫斑点法 (ELISPOT) 定量检测全血和 (或) 外周血单核细胞在 MTB 特异性抗原刺激下释放 - 干扰素的水平，用于诊断 LTBI 及辅助诊断 TB。 目前利用 IGRA 原理，有 2 种较为成熟的试剂盒，即 QuantiFERONTB GOLD In Tube 试剂盒 (QFT-GIT， Cellestis Incorporated， Carnegie， Australia) 和 T-SPOT. TB 试剂盒 (Oxford Immunotec， Abingdon，UK)， 先后被美国食品药品监督管理局 (FDA) 批准应用于临床。检测结果阳性可被判断为 MTB 感染。 IGRA 在 24h之内就可以获得结果，花费的时间比 TST 短，并且不会因为复强效应 (Booster 效应) 受到影响，可反复进行，在有试验条件的医院里，该试验的操作和管理比 TST 更便捷，不需要专门的医生多次观察结果。同 TST 一样，这种方法无法区分 LTBI 与活动性肺结核，因此，不能单独作为 TB 的确诊依据。,三、细胞免疫学检测,Nil (不与抗原共孵育的血浆中干扰素的浓度 阴性对照组)；TB antigen minus nil (与 3 种结核特异性抗原共孵育后血浆中 Y- 干扰素的浓度减去阴性组的值)；mitogen minus nil ( 与有丝分裂原抗原共孵育后血浆中 Y- 干扰素的浓度减去阴性组的值； 有丝分裂原管包含植物血凝素，能非特异性激活 T 细胞，作为阳性对照用以保证细胞对抗原的反应能力和校正血样的处理和孵。B 对于这种 IGRA，1 mL 血抽入到 3 根管中（阴性对照，阳性对照和 TB 抗原管）。计算 TB 抗原管中全血刺激产生的 干扰素和阴性对照管中的干扰素的差值作为 TB 反应。阳性结果需满足以下标准。 (1) 阴性对照小于 8 IU/mL；(2) TB 抗原管减去阴性对照管结果0.35 IU/mL，且25% 阴性对照管结果；(3) 阳性对照管有反应。,细胞免疫学检测,目前IGRA检测成本偏高，不适用于人群筛查。试验结果在一定程度上受到T 细胞水平及活性的影响，对于免疫抑制或者免疫缺陷者可能会结果不准确。虽然有资料表明对于 HIV 感染、血液病、恶性肿瘤、矽肺以及慢性肾衰者，预防性治疗 TB 潜伏感染的常用方法是 IGRA， 但对于其中严重的免疫抑制者， IGRA 的诊断价值会降低。对于中国人群来说， IGRA 并不能显示出明显超过 TST 的优势。 MTB 核酸扩增检测 (NAA) :是近年来 TB 诊断领域中最有突破的，检测手段日趋成熟。部分新型的核酸检测技术 (如分子线性探针检测) 得到了 WHO 的认可和推荐，可用于 TB 的诊断和耐药检测。理论上 NAA 敏感性很好，即使标本中只有极低拷贝数的细菌也能检出，一般 24h 之内即可取得检验结果，并且在生物安全级别上要求相对较低，还可以通过检测异烟肼和利福平的常见耐药基因位点，从而筛查出耐药 MTB。,三、分子生物学检测,4.1 标准聚合酶链式反应 (PCR) 是体外酶促合成特异 DNA 片段的一种方法，由高温变性、低温退火 (复性) 及适温延伸等几步反应组成 1 个周期，循环进行，使目的 DNA 得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。 它不仅可以通过核酸扩增检测 MTB 的存在，同时可以对特定基因位点检测来判断菌株的耐药性。理论上 PCR 对于存在细菌的标本都有较好的检出率，但实际临床上应用可能存在一定的偏差。 假阳性结果主要由靶序列或扩增产物的交叉污染所致，假阴性结果的出现主要是影响 Taq 酶活性，包括以下 2 个方面：一是临床标本中可能存在内源性抑制因子 (5%20%)， 如 DNA 样品中的蛋白质和重金属离子；二是标本溶血、血红蛋白残留、处理过程中使用苯酚等物质。,三、细胞免疫学检测,4.2 改进的核酸检测技术 传统 PCR 检测总的敏感性尚不理想，同时可能存在污染、操作失当等因素的影响，因此随后产生了多种改进手段， 包括整合的 MTB 核酸扩增检测试剂盒以及全自动化 MTB 检测系统。 前者包括如 GenProbe MTB 核酸直接扩增检测 (GenProbe amplified MTB direct test， AMTD； San Diego， CA， USA)、 罗氏 AmplicorMTB 检测 (Roche amplicor MTB test， Basel， Switzerland)、 BD-ProbeTec SDAtest (Becton Dickinson， MD， USA)， 实时荧光核酸恒温扩增检测技术 (simultaneous amplification and testing， SAT； 仁度生物，中国) 等商业试剂盒；后者主要指 GeneXpert MTB/RIF 系统 (Cepheid， USA)。,分子生物学检测,其中由于 WHO 的推荐， GeneXpert MTB/RIF 已在全球 60 多个国家使用，下文分别予以介绍。 4.2.1 GenProbe MTB 核酸直接扩增检测 恒温扩增 16S rRNA， 以 MTB 复合群特异性探针检测扩增产物，采用转录介导的扩增技术对靶核酸进行扩增，采用化学发光物哑啶酯标记的 DNA 探针与扩增的靶基因进行杂交，探针与扩增产物交叉后利用杂交保护试验去除未杂交的标记探针，最后利用化学发光仪检测发光信号，可在 2h 内做出诊断。据报道，该方法的特异度 95%， 对痰细菌培养阳性肺结核敏感度为 92%100%， 对于痰细菌培养阴性肺结核敏感度为 40%93%， 对于肺外结核敏感度约为 93%。 4.2.2 罗氏 Amplicor MTB 检测 扩增引物 16S rRNA 基因片段，然后于各种分枝杆菌菌种特异性的寡核苷酸探针进行反向斑点杂交或微孔板反向杂交鉴定菌群，部分研究表明，该方法总的特异度 95%， 对于痰细菌培养阳性肺结核检出 97%， 对痰细菌培养阴性肺结核敏感度为 40%73% ，对肺外结核敏感度为 77%98%。,分子生物学检测,4.2.3 BD-ProbeTec SDA test 半定量的链置换扩增技术，以 IS6110 和 16S rRNA 为靶序列，经加热变性后与特异性引物杂交，在 DNA 聚合酶的作用下产生带限制性核酸内切酶识别位点的靶 DNA 序列，然后核酸内切酶在其识别位点将 DNA 双链打开缺口， DNA 聚合酶继之延伸缺口 3端并替换下一条 DNA 链。被替换下来的 DNA 单链可以与引物结合并被 DNA 聚合酶延伸成双链。该过程不断反复，使靶序列高效扩增。该方法总的特异性 90%， 对于痰细菌培养阳性肺结核检出达 90%100%， 对于痰细菌培养阴性肺结核敏感度 33%100%， 对于肺外结核敏感度为76%。 4.2.4 实时荧光核酸恒温扩增检测技术 在同一温度下，首先通过 M-MLV 反转录酶产生靶标核酸的 1 个双链 DNA 拷贝，然后利用 T7 RNA 多聚酶从该 DNA 拷贝上产生多个 (1001000) RNA 拷贝；每个 RNA 拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环；同时，带有荧光标记的探针和这些 RNA 拷贝特异结合，产生荧光。该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获，直观反映扩增循环情况。 实时荧光核酸恒温扩增检测技术 试剂盒通过检测 RNA 来证实 MTB 的存在，扩增效率极高， 1530 min 即可将模板扩增 109 倍，理论上检测灵敏度和准确性远高于其他核酸检测技术；该技术采用实时荧光闭管检测，使污染得到有效控制；即使污染产生，由于扩增产物为 RNA， 环境中极易降解，从而大幅度提高检测结果的可靠性。目前该试剂盒已获批准于我国应用。,PCR原理,分子生物学检测,4.2.5 GeneXpert MTB/RIF 系统 GeneXpert MTB/RIF 检测试剂盒为美国 Cepheid 公司开发的，适用于 GeneXpert 仪器，可在 2 h 内直接从患者新鲜痰液或冻存痰液中检测是否还有 MTB 及对利福平的耐药情况，整个过程都在一密闭环境中进行，该方法采用全自动实时荧光定量 PCR 原理，将样品处理、核酸扩增、目标序列的实时检测整合于一体，通过对 MTB特有的序列 rpoB 基因上于利福平耐药相关 81bp 的核心区域 (RRDR) 进行检查。 Boehme 等在 新英格兰医学杂