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第五章 肿瘤细胞生物学,第一节 肿瘤细胞与正常细胞的差别,1、什么是癌? 什么是肿瘤? (1). 宋代(1170年)东轩居士著”卫济宝书”,首用无病框的癌字即山岩之意 (2). 16世纪罗马皇帝Marc Aurel发现乳腺癌引起的淋巴管炎螃蟹状(Krab) 2、正常细胞有什么样的结构? (1)细胞膜(双脂膜,蛋白质,糖蛋白,糖脂) (2)细胞质(亚细胞器,分泌颗粒) (3)细胞核(染色体,核仁组成区) 3、肿瘤细胞有什么样的结构? (1)细胞核(核呈多形性,染色体呈多形性, 核仁银染颗粒增多) (2)细胞质(核糖体增加,分泌颗粒增多) (3)细胞膜(某些糖蛋白减少,一些糖脂减少,受体分布改变),第二节 肿瘤的恶性增殖,1、肿瘤有那些生长特点? 2、恶性增殖有何的表现? (1)体积增大 (2)组织密度增加 (3)细胞数目增多 3、如何测定? a. 影像学测定(X-透射,B超,内窥镜,CT,核磁共振) b. 细胞学测定,4. 肿瘤恶性增殖的细胞和分子机理是什么? (1).细胞周期改变 a.细胞周期(G1,S,G2,M),(M:前,中,后,末) b.嵇查点(cheakpoint) c.正常细胞周期的调控分子 (a).种类: 细胞周期素,cyclin A,B,C,D,E(A and B in M phase; C,D and E in G1 phase); 细胞周期素依赖激酶,cyclin-dependent-kinase1-7(1 in G2 and M phase; 2 in G1,G2 and M phase, 4,5 and 6 in G1 phase); cdk活化激酶,cdk-activating kinase; 细胞分化周期蛋白25,cell division cycle 25; cdk抑制剂,cdk-inhibitor(CDI),(b).匹配:cyclin A and B combine with cdk 1 and 2; cyclin C and D pair with cdk 4, 5 and 6. (c).活化和调控: cdk-activating kinase cyclin+cdk- phospholation of Thr14+Tyr15+Thr160 of cdk cdc25 -cdk-Thr160, -CDI 调控cyclin- cdk 的活性,(d).CDI的主要种类: P21 family,including: P21(cip1/waf1/cap21/sdi1) P27(kip) P57(kip2) P16 family,including: P15(ink4B) P16(ink4A) P18(ink4C) P19(ink4D) P20 TGF family,including 1,2,3,4,5,(e). CDI的功能 P21抑制cdk2,4,5,6复合物的激酶活性,阻止细胞进入S期 P27作用cyclin-cdk复合物,使细胞停留在G1期 P16抑制cdk4/cdk6介导的Rb的磷酸化 P15结合cdk4,cdk6,抑制其激酶活性 TGF在G1后期抑制Rb蛋白磷酸化,使细胞停留在G1期,(f). 恶性肿瘤细胞周期中调控分子的改变 cyclin D1基因扩增,重排和突变 发现在乳腺癌,皮肤癌,结肠癌,食道癌,淋巴造血系统的癌中 致癌机理是:加速G1进入S期;增加转录;与原癌基因合作促 细胞增殖 Rb突变或磷酸化 发现在视网膜母细胞瘤,骨瘤,小细胞肺癌,乳腺癌等癌中 致癌机理:促细胞增殖 P16突变或缺失 发现在一些癌中 致癌机理:无法竟争结合cdk4,6因而无法抑制Rb的磷酸化, 促进细胞增殖 P27丢失 发现在白血病中 致癌机理:无法与cyclin-cdk复合物作用,无法使细胞停留在 G1期,(2). 细胞凋亡的改变 a. 细胞死亡的形式 (a). 坏死(以外),作用-肿涨-破裂-炎症 (b). 凋亡(正常),内缩-小体-被吞-无炎症 apoptosis,programmed cell death b. 凋亡相关基因的发现 (a). 线虫(C.elegans)有1090个体细胞 (b). 131个细胞在发育过程中凋亡 (c). 线虫透明,凋亡细胞易于观察 (d). 发现有15个基因影响线虫细胞的命运 c. 凋亡相关基因的种类 (a). 凋亡基因: myc,myb,bax,bcl-xs,bad,p53,ICE,hid(果蝇), ced-3 and ced-4(线虫) (b). 存活基因(凋亡抑制基因): ced-9(线虫),bcl-2,bcl- xl,bag,AL,bcr-abl,raf,腺病毒E1B,EB病毒 BHRF1 and LMP1,非洲猪热病毒LMW5-HL,杆状病毒p35,d. 凋亡基因及其产物的作用机制 p53: 诱导p21蛋白产生,抑制cyclin D-cdk 4 复合物的形成,阻止Rb磷酸 化,使细胞停止在G1期进行DNA修复.若不能修复则诱导细胞凋亡. ICE(interleukin-1B converting enzyme): (a).ced-3同源基因有:ICE.Ich-1(NEDD2),cpp32,Ich-2,(Tx,Icerel- ),Mch-2, Mch-3,Icerel-等. (b).ICE的作用机制:ICE受bcl-2抑制,当bcl-2失活时,ICE促进细胞凋 亡. (c).其它ICE同源基因的作用机制:nedd2/Ich-1二聚体诱导凋亡,但可 被bcl-2,crmA抑制;cpp32水解ADP-核糖基因聚合酶,使 PARP(poly(ADP-ribose)polymerase)在DNA断裂时的修复功能失去, 因而诱导凋亡;prICE(protease resembling ICE)可切断PARP,诱 导凋亡.,c-myc: 其功能是:(a).转录因子活性;(b).启动细胞增 殖;(c).抑制细胞分化;(d).调节细胞分化;(e).参 与细胞凋亡.c-myc高表达可导致细胞凋亡,但可被 bcl-2抑制. Fas/Apo-1:Fas也称为Apot基因,即Fs-7 associated surface protein.它是NGF受 体家族的成员.Fas 和配体FasL结合可诱导鞘磷脂酶 (sphingomyelinase) 活性,分解产物为神经酰胺 ceramide）.该产物可阻止细胞周期进行,引起细胞凋亡.,e.存活基因(凋亡抑制基因)及其产物的作用机制 bcl-2: (a). 抗氧化作用，阻止内源性氧的生成；(b).影响钙释放；(c).与p53作用形成一个杂合子，抑制p53，促进转录，使细胞存活. bcl-2家族的其他基因: bcl-xl,mcl-1,AL,bag-1等,作用机理:(a).bcl-2/bax大于bax/bax,可抑制细胞凋亡; (b).bcl-2/bcl-xs结合可释放bax,使其形成bax/bax二聚体从而使细胞凋亡; (c).bag-1与bcl-2作用可加强bcl-2的抑制细胞凋亡作用. d.细胞凋亡改变与肿瘤 (a). 抑制凋亡可导致肿瘤细胞不断增殖; (b). 促进凋亡可抑制肿瘤细胞增殖,(3). 端粒和端粒酶的改变 a. 端粒的发现: 20世纪初,Muller 等用x-射线照射细胞使染色体断裂,断裂的染色体片段可以相互连接形成双着丝粒或环状DNA.但是,天然染色体具有稳定的末端结构,末端方向不能与其它片段连接.故此,Muller提出了端粒(telomere)的概念. b. 端粒的结构特点: (a). 真核细胞端粒DNA序列富含G,并有简单的串连重复;(b).串连序列长5-8bp,可重复长达10kb;(c).人类端粒为6聚体重复,为5-TTAGGG-3,长达15kb;(d).5-3方向链延伸到末端后伸出富含C的3-5方向的长12-16个bp的单链核苷酸,并且内折以G-G配对方式连接;(e). 端粒存在有结合蛋白.它以氢键与末端DNA结合,保护大约100bp的双链末端和16bp的单链末端;(f).人类的与TTAGGG结合的是一种蛋白因子(telomeric repeat binding factor,TRF). TRF参与端粒长度的调节,是一个端粒延长的抑制剂. c. 端粒的功能: (a). 保护末端,防止降解;(b).解决末端复制问题.,d. 端粒酶的发现:1985年,Greider等首次在四膜虫中发现了一种能扩增末端DNA的酶称为端粒酶.1989年该酶被提纯.1995年人端粒酶RNA被克隆成功. e. 端粒酶的结构: 端粒酶RNA和蛋白质两部分. RNA的特点:(a). 含有与端粒DNA序列互补的(telomere DNA sequence,TEL)RNA序列; (b). 人的TEL末端为5-TTAGGG-3,四膜虫的TEL末端为5- GTTGGG-3; (c). 四膜虫的RNA有159个核苷酸. 端粒酶蛋白的特点: (a).四膜虫的蛋白有两个亚基,分别为80kd和95kd.p80与 端粒酶RNA有特殊亲合性,p95能与端粒DNA单链部分特 异结合. (b).哺乳动物端粒酶蛋白有结合亚基TP1蛋白(telomere associated protein 1)和催化亚基hest 2蛋白 . TP1与p80有广泛的同源性,但与酶活性无关. hest 2 蛋白与端粒酶活性相关.它的编码基因为HTRT(human telomerase reverse transcriptase).,f. 端粒酶的功能: 端粒酶以自身的RNA为模板,以末端DNA单链3端游离-OH为引物,在末端 添加新的端粒重复序列,使端粒延长.其反应过程为(在四膜虫中): 第一步:结合 -GGGTTG - AACCCCAAC- 第二步:聚合 -GGGTTGGGGTTG - AACCCCAAC- 第三步:移位 -GGGTTGGGGTTG - AACCCCAAC- 再聚合,再移位(重复),g. 端粒与寿命: (a). 20世纪70年代初,Olvinkov首 次提出:染色体末端逐渐丢失导致细胞最终退出 细胞周期,进而死亡.(b).Kruh等对2天,9岁,75岁 及患早老性痴呆的人群进行端粒的发现:年龄 越大端粒越短.大多数组织在分化过程中,端 粒不同程度的缩短.皮肤和淋巴细胞的端粒每 年丢失15-40bp.纤维细胞,胚胎肾细胞,上皮细 胞,卵巢细胞传代一次丢失50-200bp.,h.端粒酶与寿命 (a).端粒-端粒酶假说的提出.依据端粒在细胞寿命中 的控制作用,Harley提出了端粒-端粒酶假说. (b).假说的要点: 当细胞在有丝分裂过程中,伴随着部分端粒序列的丢失,端粒长度不断缩短. 当端粒缩短到一定程度时,就会启动某种信号,使细胞进入危机点M1期,此时细胞不再分裂并出现老化. 如果细胞被病毒转化或因抑癌基因突变,细胞会越过M1期,继续分裂.端粒细胞继续缩短,最终达到一个关键阈值.细胞进入另一个危机点M2期. 这时染色体可能出现异常形态,某些细胞端粒太短,丧失其功能,导致细胞死亡.但极少数细胞在此阶段激活端粒酶,使端粒增长,从而逃避M2期危机,获得永生性.,i. 端粒-端粒酶与肿瘤:研究发现在肿瘤组织中端粒变短或变得极短或丢失.大部分肿瘤细胞端粒长度明显短2-6kb.端粒酶被激活.在人类的肿瘤中,均发现端粒酶的表达.端粒酶活化是细胞无限增殖所必须的.端粒酶在肿瘤发生的那个阶段被活化,目前尚不清楚.端粒酶如何被活化,Counter提出了两种可能的模式:.逃避M2期危机的复活模式.扩充保留模式,即其它细胞衰老死亡.保留了本身微弱表达端粒酶的细胞.端粒酶抑制剂和端粒酶基因的反义核酸可治疗肿瘤.,第三节 肿瘤的侵润和转移,一. 什么是侵润和转移? 1.什么是侵润?(invasion) 2. 侵润的过程:脱落-侵袭-增殖 3. 什么是转移?(metastasis) 4. 转移的过程:脱落-侵袭-转移-增 殖 5.侵润和转移的差异 二. 侵润和转移会有什么样的结果? 1. 从非要害器官转移到要害器官 如皮肤黑色素瘤的肝,淋巴转移 2. 从非要害部位转移到要害部位 如大脑胶质瘤转移为大脑血管瘤,三. 侵润转移的分子机制是什么? 1. 脱落的分子机制是什么? .膜表面负电荷增多,细胞间排斥力增大,原因是唾液酸含量增高. .肿瘤组织中钙浓度降低,钙是连接邻近细胞表面负电荷的媒介. .膜表面组织粘连蛋白减少,纤维粘连蛋白具有粘合细胞作用. .谷氨酰胺合成障碍.谷氨酰胺是细胞表面粘合分子的成份.谷氨酰胺合成酶活性高,细胞粘合力强.,2. 侵袭的分子机制是什么? .脱落的肿瘤细胞能产生和释放多种水解酶.水解破坏周围细胞间质成份,包括基底膜成份,使肿瘤细胞易于扩散. .细胞间质的主要成份:a.蛋白质如胶原蛋白(有12类之多,而胶原蛋白主要存在于基底膜中),层粘链蛋白,纤维粘链蛋白等.b.透明质酸等. .水解酶类:a.蛋白水解酶(丝氨酸蛋白酶,金属蛋白酶,组织蛋白酶B,L,弹性蛋白酶).b.透明质酸酶.,3. 转移的分子机制是什么? .转移靠细胞的移动能力,这种能力依赖于一些因子和基因的作用. .因子和基因的种类: a. 细胞移动促进因子,包括60KD和120KD蛋白,其受体为78KD.其 功能是促进细胞游走. b.运动刺激因子,是一个70KD的蛋白,刺激细胞运动. c.扩散因子(scatter factor),增加各类细胞运动. d.粘附分子,肿瘤细胞产生的能与血管内皮细胞识别粘附的一类分子,包括:(a).整合素(integrin),已发现20多种,由,两个亚基构成,通过识别精-甘-天三肽介导粘附.(b).钙粘素(cadherin),一种跨膜蛋白.利用膜外结构中的组-丙-val三肽介导细胞间粘附.(c). 免役球蛋白超家族,包括ICAM-1(细胞间粘附分子),NCAM(神经粘附分子),VCAM(血管内皮细胞粘附分子)等均介导细胞间的粘附.(d). 选择素(selectin),识别糖配基的一类粘附分子.已发现有L,E 和 P三种.,e. 癌基因在转移中的作用:(a).ras癌基因.用ras基因转染细胞,其转移能力增强,型胶原酶,组织蛋白酶L,B产生增多.(b).myc癌基因高扩增如在神经母细胞瘤中.(c).fas癌基因高表达可增加大鼠乳腺癌的转移能力.(d).erb,B-2癌基因的高表达可使人乳腺癌的淋巴结转移增强. f. 其它肿瘤转移相关基因:Mts-1基因(2.1kb,101aa),鼠Mta-1,meta-1,Tiam-1,PGM21等均促进转移.,4. 增殖的分子机制是什么? (1)自或旁分泌产生大量的生长因子，已发现的生长因子有60多种。关于生长因子问题将在下一章讨论。 (2)肿瘤的血管化生长 肿瘤的血管生长特点：a.数量多密度高；d.持续生长；c.血管极少分化成熟。肿瘤血管的结构特征：a.粗糙行走紊乱；b.不规则狭窄；c.扩张或扭曲；d.血管壁薄；e.细胞间隙大；f.基底膜不完整。血管化生长的原因：a.便于供血供养；b.便于肿瘤细胞脱落转移。血管化生长的分子机制，肿瘤细胞可产生血管生成刺激因子促进血管生成，目前已经发现的血管生成刺激因子有10多种。包括：血管内皮细胞生长因子,前列腺素E1,E2,肝素酶,胎盘生长因子,干细胞生长因子,TGF-,IL-8等。,5. 如何对侵润和转移进行分子调控? (1) 抑制侵润过程：蛋白酶抑制剂(存在与黄豆中,慈菇中,血液中,微生物中)。透明质酸酶抑制剂。 (2) 抑制转移(主要通过转移抑制基因) nm23,1988年,Steeg从小鼠黑色素瘤k1735中克隆出来。它编码一个