课件：植物病原细菌学实验.ppt

植物病原细菌学实验,实验一 植物病原细菌常用培养基 的制作与灭菌,1.了解细菌培养基的种类； 2.掌握常用细菌培养基的配方和制作方法； 3.掌握培养基的灭菌方法。,一、实验目的,二、实验内容和操作方法,（1）配方：牛肉膏3，蛋白胨 10，NaCl 5，琼脂 20，蒸馏水 1000 L。,1.牛肉膏蛋白胨培养基(NA)：分离和培养最常用,（2）配制过程：将牛肉膏、蛋白胨、 NaCl 溶于蒸馏水后，调节pH7.2，加入琼脂溶化后分装于三角瓶和试管。,（一）培养基的配制,2. Hugh和Leifson（HL）培养基：细菌的好氧性和厌氧性测定 蛋白胨 2.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钾 0.2 g 琼脂 3.0 g 蒸馏水 1000.0 ml pH 7.47.8 溴百里酚兰（1.6酒精溶液 1.5 ml） 待培养基融化，并调pH后，装于试管中，每支试管装9 ml 灭菌。培养基凝固后，用接种针蘸细菌悬浮液针刺接种，一直刺到管底。分别在培养2、4和7 d后观察记录。 好氧性细菌，只在开管的上部生长；兼性厌氧性细菌，则在开管的上下部都能生长；厌氧性细菌，则只能在开管的下部和闭管中生长。,（1）配方：NH4H2PO41.0，氯化钾0.2，MgSO4.7H2O 0.2，蒸馏水1000 L，溴百里酚兰（1.6%酒精溶液）1.5 mL; 1%碳素化合物。,3.Ayers培养基：碳素化合物产酸试验,单糖（葡萄糖、半乳糖）；双糖（麦芽糖、乳糖）；多糖（淀粉）；醇（甘露醇）。 有的细菌不产酸和气，有的只产酸不产气，少数植物病原细菌既产酸又产气,（3）分装：将上述培养基分装于试管中，每管10 mL左右。如果测定气体产生，加上杜氏发酵小玻管后灭菌。 产酸时培养液变黄，产碱时变蓝，产气则小玻管内培养液被部分排出，出现空隙。,（2）配制过程：将NH4H2PO4、氯化钾、MgSO4.7H2O溶于蒸馏水，调节pH7.0后加入溴百里酚兰，最后加入碳素化合物（也可分别灭菌后加入）,4. MR和VP试验：对葡萄糖的分解能力,（1）配方：蛋白胨5，葡萄糖5，磷酸氢二钾5，蒸馏水 1000 L。,（2）配制过程：将蛋白胨、葡萄糖、磷酸氢二钾溶于蒸馏水，调节 pH7.0-7.2，每管分装5mL即可。,5. 硝酸盐还原,（1）配方：硝酸钾1.0，蛋白胨5.0，酵母膏3.0，蒸馏水1000L， pH7.0-7.2,（2）配制过程：将硝酸钾、蛋白胨、酵母膏称好后，溶解于蒸馏水后，调节 pH。,6. 半胱氨酸培养液：测定产H2S能力,（1）配方：蛋白胨10，硫酸钠0.1g，半胱氨酸0.1g，蒸馏水1000L。,（2）配制过程：将半胱氨酸、蛋白胨、硫酸钠称好后，溶解于水中，调节 pH7.0-7.3即可。,7. 吲哚试验,（1）配方： 蛋白胨20.0，磷酸氢二钠2.0g，葡萄糖10.0g，蒸馏水1000L。,（2）配制过程：将蛋白胨等称好后，溶解于蒸馏水，调节pH7.0-7.2即可。,8. 明胶液化,（1）配方： 牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0，明胶10-12%，蒸馏水1000L。,（2）配制过程：将牛肉浸膏、蛋白胨溶解于蒸馏水中，调节pH7.0-7.2后，将明胶溶解于此溶液中，即可分装于试管中。,9. 淀粉水解试验,（1）配方： 牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨17.5， 淀粉1.5 g，琼脂15-20 g，蒸馏水1000 L。,（2）配制过程：将牛肉浸膏、蛋白胨、淀粉称好后，溶解于蒸馏水中，加入称好的琼脂，待融化后调节pH7.0-7.2。,10. 石蕊牛乳反应,（1）配方： 脱脂牛乳1000 L ， 石蕊液（4%）15-20 mL。,（2）配制过程：提前配制石蕊液,（二）培养基的灭菌,上述培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌。普通培养基为1212030min，以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成份。培养基经灭菌后，如需要作斜面固体培养基，则灭菌后立即摆放成斜面，斜面长度一般以不超过试管长度的1/2为宜；半固体培养基灭菌后，垂直冷凝成半固体深层琼脂。,明胶培养基灭菌12-15分钟。 石蕊牛乳培养基间歇灭菌3次，每次通蒸汽20-30 分钟。,灭菌方法 灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生 物，灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。 本实验主要介绍物理方法的一种，即加热灭菌。,加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。 通过加热使菌体内蛋白质凝固变性，从而达到杀菌目的。 高压蒸汽灭菌法 高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。,当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时，水蒸气的温度升高到121，经2030min，可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。 一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌。 操作方法和注意事项如下: 加水 打开灭菌锅盖，向锅内加水到水位线。注意水要加够，防止灭菌过程中干锅。,装料、加盖 灭菌材料放好后，关闭灭菌器盖，采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺旋，使蒸汽锅密闭，勿使漏气。 排气 打开放气阀。用电炉加热，待水煮沸后，水蒸气和空气一起从排气孔排出，当有大量蒸汽排出时，维持5min，使锅内冷空气完全排净。,升压、保压和降压 当锅内冷空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。当压力上升至所需压力时，控制电压以维持恒温，并开始计算灭菌时间，待时间达到要求（一般培养基和器皿灭菌控制在121，20min）后，停止加热，待压力降至接近“0”时，打开放气阀。 注意不能过早过急地排气，否则会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外。,干热灭菌法 通过使用干热空气杀灭微生物的方法叫干热灭菌。一般是把待灭菌的物品包装就绪后，放入电烘箱中烘烤，即加热至160170维持12h。 干热灭菌法常用于空玻璃器皿、金属器具的灭菌。 凡带有胶皮的物品，液体及固体培养基等都不能用此法灭菌。,1 细菌（NA）和真菌(PDA)常用培养基的配方和制 作过程有何异同点？ 2 试述高压蒸汽灭菌的操作方法和注意事项。,三、作业,实验二 植物病原细菌的分离 和致病性测定,二、实验内容和操作方法,（1）首先要选择典型、新鲜病组织; （2）以灭菌剪将病斑剪下，略带健康组织，大小约0.51公分左右，放在灭菌载玻片中央，加无菌水1d。加上灭菌盖玻片，静置约10min左右，观察是否有云雾状自破口处涌出,（一）细菌溢现象观察,（1）斑点型：如棉花角斑病。 A. 剪取新鲜的典型病斑，约1cm见方。,（二）植物病原细菌的分离,1. 细菌悬浮液的配制（不同症状类型分离材料的选择和表面消毒）,B.表面消毒：将切取的组织块在70乙醇中浸一下立即取出，然后用表面消毒剂进行表面消毒，可以采用0.1升汞，152min或0.5的次亚氯酸盐如漂白粉（1：9稀释液）2min C.消毒后用灭菌水洗涤3次，将病组织放在另一个培养皿的灭菌水中，剪破中心或以灭菌玻璃棒研碎病组织静置2030分钟，等细菌游出。,（2）萎蔫型如茄青枯病 将茎部剪成12寸长，表面用70酒精轻拭，在火焰上表面消毒，以灭菌刀纵剖，选择轻微变色病部，以灭菌刀切出薄片或以解剖针挑出病健交界处组织（可以不再消毒），加灭菌水浸泡20-30分钟。 如果茎部较粗，也可以在表面消毒后用解剖刀横断茎部，用夹子或手紧压茎部横断面，挤出溢脓或汁液。,（3）肿瘤组织,软瘤比较容易分离；木质瘤可以磨碎后接种在向日葵、番茄等幼株上长出瘤后再分离。 由于细菌位于表皮细胞和木质部之间，因此应用酒精棉花擦拭表面，在火焰上表面消毒，再在灭菌皿中实行解剖后以灭菌玻棒将其捣碎，静置浸泡24h。,（4）腐烂组织,较简单，选择近病部交界处以接种环挑取少量腐烂组织，稀释。,（5）种子带菌的分离,选择病种子，以0.1升汞液表面消毒12min，灭菌水洗涤，再将此种子在70酒精中浸几分钟，洗涤23次，取出放在研钵中磨碎，离心取上清液。,2. 分离方法,A.倒平板：注意培养基的温度不能太高，否则冷凝水太多，细菌在水中游动而影响单个分散菌落的形成。,（1）平板划线分离法：被普遍采用,B.用接种环蘸取上述配制好的菌悬液，在已凝固的平板培养基表面划线,（2）培养皿稀释分离法,3.培养,一般放置在 2830温箱中倒置培养，时间23 d。,将冷却至45左右的培养基倒入装有稀释菌液的培养皿中，轻轻转动培养皿，使菌液和培养基混匀，待其凝固后培养。,4.细菌的纯化,挑取分离出的典型单菌落平板划线培养（2皿），如此重复12次，最后，在均匀一致的平板中，挑取典型菌落移植在斜面培养基上培养，长成后在4环境中保存菌种。,1. 配制107-108CFU/mL的细菌悬浮液，菌龄48小时左右；,（二）致病性测定,2. 指示植物的选择：一般用烟草，在假单胞和黄单胞菌属上较适用。,3. 接种方法：用注射器将细菌液从烟草下表皮注入叶肉细胞间。用灭菌水作阴性对照，同属HR阳性的菌株作阳性对照。,4. 培养条件：接种后的植物应保持在25，相对湿度较高（85%）的条件下。,5. 结果观察：在2448h表现枯斑为阳性反应，3d左右出现黄斑为阴性反应。,三 作业： 1.简述本实验中植物病原细菌的分离步骤及其操作注意事项 2. 烟草过敏性反应试验能够确定细菌的致病性吗？为什么？,实验三 植物病原细菌的形态观察,1.了解革兰氏染色鉴定的快速鉴定方法； 2.掌握革兰氏染色和鞭毛染色的方法； 3.掌握细菌培养性状的描述特征。,一、实验目的,二、实验内容和操作方法,1.结晶紫草酸铵染色,（一）革兰氏染色,（1）试剂,A. 结晶紫草酸铵染剂：,溶液：结晶紫2.0g，酒精（95%）20mL,混合溶液和，过滤，贮藏于试剂瓶中，24h后使用。,溶液：草酸铵0.8g，蒸馏水80mL,C.复染剂,原液：番红O 2.5g，95%酒精100mL,复染剂：原液10mL，蒸馏水90mL,B. 鲁戈尔碘液：碘1.0g，碘化钾2g蒸馏水300mL。,将碘和碘化钾在研钵中研和，慢慢加水并继续研和直至碘和碘化钾溶解，然后加水稀释到300mL，盛入棕色试剂瓶，放暗处备用。,（2）染色程序,A. 配制细菌悬浮液：菌龄16h,B. 在干净的载玻片上涂片、风干，不要加热，然后在火焰上通过2次，固定玻片。,C. 结晶紫染色1分钟，水洗数秒钟，吸干。,D. 碘液处理1分钟，水洗，吸干。,E. 用95%酒精褪色约30秒。水洗，吸干,F. 番红O复染10秒，水洗，吸干,G. 加1滴香柏油，在油镜下镜检，红色为革兰氏阴性菌，紫色为革兰氏阳性菌。,2. 氢氧化钾溶解试验,（1）试剂：3氢氧化钾,（2）方法：取12滴3氢氧化钾溶液置于干净的 玻片上，用牙签取新鲜细菌培养物与氢氧化钾混合，充分搅拌1020秒，如果液滴变粘稠并可拉出丝状物体，表示测试菌为革兰氏阴性菌，反之则为革兰氏阳性菌。,1.试剂,（二）鞭毛染色（西萨基尔法）,（1）媒染剂：单宁酸10g，ALCL3.6H2O 18g， ZnCL2 10g，碱性品红1.5g，60%酒精40mL,在研钵中加入酒精和上述各种成分，充分研磨后，再加入其余的酒精。使用前用蒸馏水稀释2倍，染色时过滤，滤液直接滴在涂片上。,溶液：碱性品红0.3g，酒精（95%）10mL,溶液和分别配制后混合。,溶液：苯酚（结晶）5g，蒸馏水95mL,（2）染液：,2. 染色步骤,（1）载玻片准备：选用新的或没有伤痕的，先用洗洁精浸泡洗涤，用清水洗净后，再放入酸酒精（硫酸与酒精等量混合）中浸泡24-48h，取出后用清水洗净，再用蒸馏水洗，沥干水后，浸泡在95%酒精中备用。,（2）配制细菌悬浮液，菌龄很重要，一般适温培养16-24h。用吸管沿试管壁缓缓加入无菌水5mL，静置30分钟左右，配成菌悬液。,（3）涂片：取浸在酒精中的载玻片，在火焰上烧去酒精，平放，用吸管吸取细菌悬浮液（以上层为好）在载玻片的一端滴一滴，然后将载玻片稍稍倾斜，使菌悬液从一端缓缓流向另一端，使涂片自然风干。,（4）媒染剂过滤后，直接将滤液滴在涂片上，处理5-7分钟,（5）用水轻轻洗去染媒剂，甩去载玻片上剩余的水，在空气中干燥后，再加苯酚品红染剂染色5分钟。,（6）水洗，在空气中干燥后，加1滴香柏油，在油镜下观察鞭毛的数量和着生位置。,1.革兰氏染色反应和鞭毛染色在植物病原细菌鉴定中有何作用？为什么？ 2.细菌鞭毛染色对菌龄的要求比较严格，在操作过程中也要注意动作的轻柔，为什么？ 3 观察和记录NA平板上的细菌菌落性状、菌体形状、运动性和革兰氏染色结果。,三 作业,实验四 植物病原细菌生理生化测定,1. 掌握无菌操作技术； 2. 了解各种生理生化性状测定常用试剂的配制方法； 3. 掌握各种生理生化性状的观察方法。,一、实验目的,二、实验内容和方法,1.产酸和产气试验,（一）碳素化合物的利用,1）接菌培养：一般每5 mL培养液接种0.1mL 108 CFU/ml菌悬液，适温下培养3-4周。,2）结果观察：,（1）配方：NH4H2PO41.0，氯化钾0.2，MgSO4.7H2O 0.2，蒸馏水1000 L，溴百里酚兰（1.6%酒精溶液）1.5 mL; 1%碳素化合物。,Ayers培养基：碳素化合物产酸试验,单糖（葡萄糖、半乳糖）；双糖（麦芽糖、乳糖）；多糖（淀粉）；醇（甘露醇）。 有的细菌不产酸和气，有的只产酸不产气，少数植物病原细菌既产酸又产气,（3）分装：将上述培养基分装于试管中，每管10 mL左右。测定气体产生时，加上杜氏发酵小玻管后灭菌。,（2）配制过程：将NH4H2PO4、氯化钾、MgSO4.7H2O溶于蒸馏水，调节pH7.0后加入溴百里酚兰，最后加入碳素化合物（也可分别灭菌后加入）,3）MR试验结果观察：取上述培养液5ml，加甲基红试剂23滴，呈明显红色为阳性，呈黄色为阴性。,2.甲基红(MR)和VP(产3-羟基丁酮)试验,1）接菌培养：一般每5mL培养液接种0.1mL108CFU菌悬液，适温下培养1周。,2）甲基红试剂配制：甲基红0.1g溶解于300ml的95%酒精中，然后用蒸馏水稀释至500ml。,4）VP试验结果观察：每毫升加0.1mL40%KOH溶液, 置48-50水浴处理2h，充分摇动后观察结果。在4h内出现红色者为阳性反应。,测定亚硝酸，每试管加试剂A和试剂B各1ml如呈红色，表示有亚硝酸根。,1）接菌：在培养液中接菌后培养1周,（二）氮素化合物的分解,2）Griess-Llosvary试剂测定法,试剂A：对氨基苯磺酸8.0g，5mol/L醋酸（286.0ml冰醋酸加715.0ml水）1000ml,试剂B：二甲基-萘胺6ml，5mol/L醋酸1000ml,1.硝酸盐还原,1）醋酸铅滤纸条的制备：将滤纸剪成5mm50mm的小条浸在5%醋酸铅溶液中，空气中干燥后，在120烘箱中灭菌1h。,2）接菌：将细菌接种于试管中的培养液中后，用上述制备的滤纸条夹在棉花塞和试管壁之间，使纸条悬在培养液面上，但不要碰到培养液，25培养2周。,3）结果观察：纸条变黑表示有硫化氢产生，为阳性反应。,2.硫化氢产生,1）草酸滤纸条的制备：将滤纸剪成5mm50mm的小条浸在饱和草酸溶液中，空气中干燥后，在120烘箱中灭菌1h。,2）接菌：将细菌接种于试管中的培养液中后，用上述制备的滤纸条夹在棉花塞和试管壁之间，使纸条悬在培养液面上，但不要碰到培养液，适温培养1周。,3）结果观察：纸条变淡红色表示有吲哚产生，为阳性反应。,3.吲哚产生,1）接菌：采用穿刺法接菌后，放在适温中培养1-3周。以不接菌试管为对照。,（三）大分子化合物的利用,2）结果观察：将经过培养的接菌试管取出后，放在4冰箱中，看其是否凝固，如不凝固，则说明明胶分解而导致液化，为阳性反应。,1.明胶液化,A.酸的产生：石蕊牛乳变成粉红色，表示从乳糖产酸,1）接菌：将培养基接种细菌于28培养1-3周，以不接种的石蕊牛乳做对照。,2）结果观察：,2.石蕊牛乳反应,B.凝固：产酸达到pH4.7发生凝块，如产气凝块断裂； 凝乳酶的作用而凝固，凝块收缩与乳清分离。,C.胨化：牛乳变清，往往从表层开始,D.碱的产生：石蕊牛乳变蓝色，胨化时常呈碱性,E.石蕊还原：石蕊变为无色,在平板上加碘液后，培养基为深兰色，菌落周围有无色透明圈者为阳性。,1）接菌：将细菌接种于淀粉琼脂平板上，适温下培养24-48小时。,2）结果观察：,3. 淀粉水解试验,四、细菌的好氧性和厌氧性测定 蛋白胨 2.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钾 0.2 g 琼脂 3.0 g 蒸馏水 1000.0 ml pH 7.47.8 溴百里酚兰（1.6酒精溶液 1.5 ml） 待培养基融化，并调pH后，装于试管中，每支试管装9 ml 灭菌。培养基凝固后，用接种针蘸细菌悬浮液针刺接种，一直刺到管底。分别在培养2、4和7 d后观察记录。 好氧性细菌，只在开管的上部生长；兼性厌氧性细菌，则在开管的上下部都能生长；厌氧性细菌，则只能在开管的下部和闭管中生长。,1）试剂：1%二甲基对苯二胺盐酸盐或1%四甲基对苯二胺盐酸盐。,（五）其他生理生化试验,2）测定方法：,1.氧化酶试验,A. Kovacs：在培养皿内放一张滤纸，滤纸上加3-4滴试剂使其湿润，用牙签挑取24h菌苔涂在滤纸上，60秒内变成紫色为阳性反应，60秒后或不便色为阴性。,B.滤纸条法：用滤纸条蘸少许菌苔，加1d试剂，立即呈粉红色为阳性,1）试剂：3%过氧化氢,2）测定方法：挑取固体培养基上培养24-48h的菌苔，置于干净玻片上，滴加过氧化氢。,2.过氧化氢酶（接触酶）试验,3）结果观察：在半分钟内有大量气泡产生的为阳性，不产生气泡的为阴性。,三 作业：,1 若有吲哚和硫化氢产生，其实验的试管口上的滤纸条会发生什么样的颜色变化，为什么？ 2 在石蕊牛乳不能和其他细菌培养基一起灭菌，为什么？反应中会出现多种不同的反应，试分析其发生的原因？ 3 观察和记录细菌氧化发酵试验、MR试验以及接触酶试验结果。,实验五 植物病原细菌的PCR分子鉴定,1 了解PCR反应的原理； 掌握PCR反应的操作方法。,一、实验目的,二、PCR扩增 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）,1、PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与目标序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性-退火-延伸三个反应步骤构成： 模板DNA的变性：模板DNA经加热至94左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链（以便它与引物结合，为下轮反应作准备）； 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；,引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,2 The procedure of PCR,d.NTPs,Taq,Primers,component,denaturation,(94),extension,repeated,anneal,(72),(50),5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,2 cycles 4 copies,3 cycles 8 copies,5,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,3,5,5,3,5,3,5,3,5,3,3 反应体系 取一0.5 ml PCR薄壁管，依次加入以下试剂：,M 1 2 3 4,3kb,2kb,0.8% agrose gel electrophoresis of full length PCR product from Y160 M: DNA marker; 1: Y160; 2:positive control; 3 4: CK-,2.7kb,引物量： 每条引物的浓度0.11umol或10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 酶及其浓度： 目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。,4 PCR反应操作注意事项：,dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.07.5，小量分装， -20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。,模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一。 Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。,PCR反应条件的选择 PCR反应条件为温度、时间和循环次数。 温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。,变性温度与时间： 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，9394lmin足以使模板DNA变性，若低于93则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。,退火(复性)温度与时间： 重要因素。变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。 延伸温度与时间： PCR反应的延伸温度一般选择在7075之间，常用温度为72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。,PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。34kb的靶序列需34min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸