课件：第三十四篇抗微生物药物与敏感性试验.ppt

第三十四章 抗微生物药物和敏感性试验,2019,-,1,第一节 临床常用抗菌药物,抗菌药物是指具有杀菌或抑菌活性 的抗生素和化学合成药物。前者是 真菌、放线菌、细菌等的代谢产物， 后者是经化学改造的半合成抗生素 和化学合成药物。,2019,-,2,一、青霉素类抗生素：包括青霉素G、耐 青霉素酶青霉素、广谱青霉素等。 二、头孢菌素类抗生素：包括第一代、第 二代、第三代头胞菌素。 三、其他内酰胺类抗生素 （一）单环内酰胺类抗生素，主要 有氨曲南和卡芦莫南。,2019,-,3,（二）头霉素类和氧头孢烯类抗生素，主 要有头孢西丁、头孢替坦、头孢美唑。 （三）碳青霉烯类抗生素，主要有亚胺培南、 米洛培南、必安培南、帕尼培南。 （四）内酰胺类抑制剂，主要有克拉维 酸、舒巴坦和他唑巴坦。,2019,-,4,四、氨基糖苷类抗生素 按其来源分为：由链霉菌属发酵滤液提 取获得，有链霉素、卡那霉素、妥布霉素、 核糖霉素、巴龙霉素、新霉素；由小单 胞菌属发酵滤液中提取，有庆大霉素、福 提霉素；半合成氨基糖苷类，有阿米卡 星、奈替米星、地贝卡星等。,2019,-,5,五、喹诺酮类抗生素 第一代为窄谱抗生素，有新恶酸、奈啶 酸和恶喹酸。 第二代为广谱类抗生素，抗菌强度依次 为环丙沙星、氧氟沙星、洛美沙 星、氟咯沙星、培氟沙星、诺氟 沙星。 第三代为超广谱类抗生素，有司帕沙星、 妥舒沙星、左氟沙星等。,2019,-,6,六、大环内酯类抗生素，常用的有红霉素、 柱晶白霉素、麦迪霉素、乙酰螺旋霉素。 七、四环素、氯霉素和林可酰胺类抗生素 （一）四环素为广谱抗生素，抗菌活性 的顺序为米诺环素多西环素美他 环素地美环素。,2019,-,7,（二）氯霉素类抗生素，包括氯霉素、 甲砜霉素。 （三）林可酰胺类抗生素，主要有盐酸 林可霉素、克林霉素。 八、糖肽类抗生素，常用的有万古霉素 和替卡拉宁,2019,-,8,九、磺胺类药物及增效剂分三类： 用于全身感染的药物，分为短效、 中效、长效三类，有磺胺甲恶唑， 磺胺嘧啶、磺胺甲氧吡嗪； 肠道起作用的药物有柳氮磺胺啶银、 磺胺二甲氧嘧啶； 局部应用的药物有磺胺米隆、磺胺 醋酰钠。,2019,-,9,十、其他合成抗菌药 （一）硝基呋喃类 用于肠道、尿路感染和 外用消毒 ，有呋喃坦啶和呋喃唑酮。 （二）硝基咪唑类对厌氧菌有抗菌作用，对 需氧菌无效，有甲硝唑和替硝唑。,2019,-,10,第二节 抗菌药物敏感性试验 （AST）,一、意义 可预测抗菌治疗的效果， “敏感”治疗可能有效； “耐药” 肯定失败； 指导医生选择使用抗生素，AST的结果为“耐药”，即应更换药物； 提供所选择药物的依据； 监测耐药性，分析耐药菌变迁，掌握耐药菌感染 病流行病学，控制和预防耐药菌感染发生和流行。,2019,-,11,二、试验常规抗菌药物选择,在标准中分成A、B、C 、 U四组, A组所列的抗生素为常规首选药敏试验药物, B组为临床使用主要抗生素,尤其在医院感染时 使用的抗生素，可在下列情况下使用：对A组 同类抗生素耐药；标本来源不同时，如三代头 孢菌素使用于脑脊液中的肠杆菌，磺胺甲恶唑使 用于尿道分离的细菌；多种微生物感染；多 部位感染；感染流行的控制；对A组抗生素 过敏、耐受或无反应。,2019,-,12,C组药物用于对A组药物耐药的流行菌株或 对A组药物过敏的病人和某些不常见的细菌 （如肠外分离的沙门菌属或耐万古霉素肠 球菌）。 U组仅用于尿道中分离的细菌，不作为尿道 外分离菌的常规药敏试验。,2019,-,13,(一）非苛养菌药敏试验抗生素的选用,A组一级试验并常规报告的抗微生物药 , 如葡萄球菌属用苯唑西林和青霉素。 B组一级试验有选择报告的抗微生物药 , 如肠球菌属用万古霉素 。 C组补充试验有选择报告的抗微生物药， 如葡萄球菌属用氯霉素 。 U组仅用于泌尿道的补充实验的抗微生物 药，如葡萄球菌属用洛美沙星和诺氟沙星。,2019,-,14,(二）苛养菌药敏试验抗生素的选用,A组一级试验并常规报告的抗微生物药 , 如肺炎链球菌用红霉素和青霉素。 B组一级试验有选择报告的抗微生物药 , 如肺炎链球菌用头孢噻肟或头孢曲松 。 C组补充试验有选择报告的抗微生物药， 如肺炎链球菌用头孢呋辛 。,2019,-,15,三、稀 释 法,琼脂选择法是将药物混匀于琼脂培养基中，配 制含不同浓度药物平板，使用多头接种器接种 细菌，经孵育后观察细菌生长情况，以抑制细 菌生长的琼脂平板所含药物浓度测得MIC。 结果判断将平板置于暗色、无反光表面上判断 试验终点，以抑制细菌生长的药物稀释度为终 点浓度（磺胺可见少许散在细菌生长）。 试验菌的结果报告可用MIC（g/ml ）或用敏 感（S）、中介（I）和耐药（R）报告。,2019,-,16,四、纸片琼脂扩散法,（一）试验原理 将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种 测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药 物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周 围扩散形成递减的梯度浓度在纸片周围 抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制， 从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的 敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负 相关关系。,2019,-,17,(二)培养基和抗菌药物纸片,1抗菌药物纸片 选择直径为635mm， 吸水量为20l的专用药敏纸片用逐 片加样或浸泡方法使每片含药量达规 定所示。含药纸片密封贮存28 且不超过1周。 2培养基 水解酪蛋白（MH）培养基是 兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验标准培 养基，4保存。,2019,-,18,（三）细菌接种 用05麦氏比浊标准的菌液浓度，在琼 脂表面均匀涂片,在15min内接种完毕。 将含药纸片紧贴于琼脂表面, 35孵育 18h后阅读结果。 （四）结果判断和报告 用精确度为1mm的游标卡尺量取抑菌圈 直径。根据NCCLS标准，作出“敏感”,“ 耐药”和“中介”的判断。,2019,-,19,五、E 试 验,（一）原理 E试条是一条 5mm50mm的无孔试剂载体，一 面固定有预先制备的，浓度呈连续指数增长稀释 抗生素，另一面有读数和判别的刻度。将E试条放 在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕 试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交 点的刻度浓度即为抗生素抑制细菌的特定浓度， 又称抑制浓度（IC），它与MIC呈高度相关。,2019,-,20,（二）细菌接种和加样 使用厚度为4mmMH琼脂平板，用05麦氏 浓度的对数期菌液涂布，待琼脂平板完全 干燥，用E试验加样器将试条放在已接种细 菌的平板表面，试条全长应与琼脂平板紧 密接触，试条MIC刻度面朝上浓度最大处靠 平板边缘。,2019,-,21,（三）结果判断和报告 读取椭圆环与E试验试条的交界点IC值。 与NCCLS的稀释法MIC参考值高度相关。,2019,-,22,六、药物敏感试验结果解释,“敏感”即表示测试菌可被测定药物常规剂 量给药后在体内达到的血药浓度所抑制； “耐药”即表示测试菌不能被在体内感染部 位可能达到的抗菌药物浓度所抑制，临 床治疗无效。 “中介”者提示该细菌对常规用药体液或组 织中的药物浓度的反应率低于敏感株，使 用高于正常给药量有疗效。,2019,-,23,七、联合药物敏感试验和杀菌试验,（一）意义 目的在于：治疗混合性感染； 预防或推迟细菌抗生素耐 药性的发生； 联合用药可以减少剂量以 避免达到毒性剂量； 联合用药比单一用药时效 果更好。,2019,-,24,出现4种结果： 无关作用小，两种药物联合作用的活性 等于其单独活性； 桔抗作用，两种药物联合作用显著低于 单独抗菌活性； 累加作用，两种药物联合作用时的活性 等于两种单独抗菌活性之和； 协同作用，两种药物联合作用显著大于 其单独作用的总和。,2019,-,25,协同作用发生原理 联合用药的抗菌药物在不同部位抑制细 菌细胞壁合成或封闭细菌的新陈代谢； 内酰胺类抗生素增加了氨基糖苷类 药物进入细菌细胞； 联合用药的抗菌物之一是抑制内酰 胺酶活性的药物。 联合用药时，必须做联合抗菌药物敏感 性试验。,2019,-,26,（二）联合抑菌试验,棋盘稀释法是常用的定量方法，首先 分别测定拟联合的抗菌药物对检测菌 的MIC。药物最高浓度为MIC的2倍，对 倍稀释。两种药物的稀释分别在方阵的 纵列和横列进行，这样在每管（孔）中 可得到不同浓度组合的两种药物混合液。 接种菌量为5105CUFml，35孵育 18h后观察结果。计算部分抑菌浓度 （FIC）指数。,2019,-,27,FIC指数 0 5为协同作用；051为相加 作用； 12为无关作用；2为拮抗 作用。,2019,-,28,（三）最低杀菌浓度测定,MBC是指能杀灭999以上测试菌量的 最低药物浓度，常规测试的方法包括培 养基、药物稀释、细菌悬液接种等，与 MIC测定法相同。,2019,-,29,八、监控抗生素的治疗效果试验,（一）血清抗菌药物浓度测定 血清抗菌药物浓度和抗菌药物疗效密切相 关，为保证感染组织中有效浓度，血药浓 度应该达到致病细菌MIC2倍以上。但某些 抗生素治疗浓度和中毒浓度相近，过高的 血药浓度引起毒性反应，因而监测血清抗 菌药物浓度十分重要。,2019,-,30,微生物测定法,与琼脂扩散法原理相似。用已知含药浓度 的纸片加到混有一定指示菌悬液浓度的倾 注平板表面，35孵育1620h，量取抑菌 圈直径。以抑菌圈直径为横坐标，含药浓 度为纵坐标，画出标准曲线。然后在标准 曲线找出体液测试的抑菌圈直径相应的含 药浓度。,2019,-,31,（二）血清抗菌活性测定,体内抗菌药物活力的测定方法即为抑菌 力和杀菌力测定，称为血清杀菌活力试 验。 本法是取感染患者血液分离的血清对感 染部位分离确证的病原菌的抑菌和杀菌 能力，为供临床现用抗菌药的疗效考核 评价以及感染预后的判断提供实验依据。,2019,-,32,采用体外抑菌试验和体外杀菌试验。无肉 眼可见菌生长的血清最高稀释管代表患者 血清的抑菌力，其菌落计数等于或小于0.1 最初接种菌量的血清最高稀释管代表患者 血清杀菌力。血清抑菌力杀菌力1：8 常提示治疗方案有效。,2019,-,33,九、自动化仪器检测,ViterATB系统和Microscan是半自 动或全自动细菌鉴定和药敏系统，通 过系统中药敏专家系统可报告分离菌 的药敏结果。,2019,-,34,第三节 细菌耐药性和产生机制,一、细菌的耐药性 对某种抗菌药物敏感细菌变成对该药 物耐受称细菌耐药性。它可分为天然耐 药和获得性耐药，前者是通过染色体DNA 突变而致，后者往往是由质粒。噬菌体 及其他遗传物质携带外来DNA片段导致产 生的耐药性。,2019,-,35,突变可由细菌自发产生或在X线等物理因素 或化学物质诱导产生，一般只对一种或两 种相似药物耐药，在细菌耐药性上不占主 要地位。接合型质粒通过接合方式，非接 合型质粒通过转化。转导、转换形式产生 耐药 。,2019,-,36,二、细菌耐药性的生物化学机制,1.产生内酰胺酶，水解药物内酰 胺环而失去抗菌活性。 2.产生钝化酶使抗生素失活 ，钝化酶有三类： 氨基糖着类钝化酶 ； 氯霉素乙酸转移酶； 红霉素酶和其他灭活酶。,2019,-,37,3.青霉素结合蛋自改变导致对抗生素的 亲和力下降 。 4.药物作用靶位的改变使抗生素不易结 合产生耐药性。 5.抗菌药物渗透障碍，如外膜蛋白减少 和药物外排作用等。 6.代谢途径的改变 。,2019,-,38,第四节 细菌耐药性检查方法,一、细菌耐药性表型检测 某些特殊菌耐药表型检测的方法： （一）琼脂筛选试验 以单一药物单一浓度检测耐药性称耐药筛选试 验，临床上常用于对耐甲氧西林葡萄球菌、耐 万古霉素肠球菌，对庆大霉素或链霉素高水平 耐药的肠球菌。在含一定浓度测试药物的特殊 培养上，点种05麦氏比浊度直接菌落配制细 菌悬液，35孵育24h后观察平板上是否有菌 落生长识要有1个菌落生长，均视为耐药。,2019,-,39,（二）折点敏感试验,仅用特定抗生素浓度（敏感、中介或耐药 折点MIC）而不使用测定MIC时所用系列对 倍抗生素浓度测试细菌对药物的敏感性称 折点敏感试验。当选择区分中介和耐药折 点值药物浓度时，若两种抗药物浓度培养 基均生长可判断为耐药；如在两种药物浓 度均不生长则为敏感；仅在较低药物浓度 培养基中生长提示为中介。,2019,-,40,（三）双相纸片试验,挑取在血平板上菌落，稀释成05 麦氏 浓度菌液。均匀涂布于 MH平板。中央贴 上阿莫西林/克拉维酸纸片，在距该纸片 25mm处分别贴头孢噻肟或头孢曲松 、头 孢他啶和氨曲南等药敏纸片作为指示剂， 35孵育18h观察结果。若指示剂在朝向 阿莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大的 现象（协同现象），则说明待检菌产生超 广谱内酰胺酶。,2019,-,41,（四）自动化仪器,自动化仪器Microscan有测定抗菌药物抑 菌的MIC值功能。 原理是先测定细菌对抗生素的MIC值，当头 孢他啶与头孢他啶十克拉维酸的MIC比值或 头孢噻肟与头孢噻肟十克拉维酸的MIC比值 大于或等于8（即3个对倍稀释度）即判定 为此细菌产生ESBL。,2019,-,42,二、 内酰胺酶检测,1.头孢哨噻吩滤纸片法 用接种环挑取受试菌于商品化头孢哨噻 吩滤纸片上，于10分钟内由黄色转变为 红色即阳性结果，示产色头孢菌素的 内酰胺环被酶打开。,2019,-,43,2 .碘淀粉测定法 用接种环挑取受试菌混于青霉素溶液中， 室温下振摇30分钟。加入淀粉液后，再加 入碘液，溶液变蓝，继续振摇。若检测菌 产生酶，则可水解青霉素内酰胺环变 为青霉素噻唑酸，后者与碘结合，使碘淀 粉复合物转变为无色，10分钟之内蓝色消 失者为产酶株。,2019,-,44,三、耐药基因检测 （一）常见的耐药基因举例,2019,-,45,（二）耐药性基因检测方法,1.PCR 扩增目标DNA，用琼脂糖电泳，探 针杂交技术或DNA序列测定确定扩增子， 标准PCR扩增再用琼脂糖电泳分析扩增 子的大小。或用标记探针杂交RFLP分析 或 DNA序列测定确定扩增子。,2019,-,46,2.PCRRFLP分析,即限制性片段长度多态性分析。扩增后 的DNA用内切酶消化，由于碱基组成不同， 而产生不同长度的酶切片段，再经琼脂 糖电泳，就可反映出基因组DNA碱基序列 组成与已知耐药基因序列是否存在差异。,2019,-,47,3PCRSSCP分析,即单链构象多态性分析。PCR扩增后DNA变 性形成单链，然后电泳，单链核苷酸在聚 丙烯酸胺凝胶中电泳的迁移率与核苷酸的 空间构型密切相关。若单链核苷酸的序列 发生突变，甚至是当个碱基的变化，其空 间构型都有不同，电泳迁移率也不同。,2019,-,48,4PCR线性探针分析,依据耐药基因，设计包含常见突变位点的 不同寡核苷酸探针（R探针），同时设计 该基因的正常序列的探针(S探针），分别 固定在硝酸纤维素膜上，与待检株PCR扩增 产物以平行线方式杂交。杂交后显色，若 扩增产物与S探针杂交阴性，与R探针杂交 阳性，则为耐药株，反之为敏感株。,2019,-,49,5生物芯片技术,是由固定于不同种类支持介质上的高密 度的寡核苷酸分子、基因片段或多肽分 子的微阵列组成生物芯片。当荧光标记 的靶分子与芯片上的探针分子结合后， 可通过激光共聚焦荧光扫描或电荷偶联 摄像机对荧光信号的强度进行检测，从 而对杂交结果进行量化分析。,2019,-,50,6自动DNA测序,PCR扩增待测基因后，扩增产物可直 接测序，并准确判定碱基突变的位点。,2019,-,51,四、特殊耐药菌检测,（一）耐甲氧西林葡萄球菌检测 1定义 1g苯唑西林纸片的抑菌圈直径 10mm，或其MIC4gml的金黄色 葡萄球菌。对1g苯唑西林抑菌圈直径 17mm，或MIC 05gml的凝固 酶阴性葡萄球菌称耐甲氧西林葡萄球菌 （MRS）。,2019,-,52,2临床意义,MRS不论其体外药敏试验结果，所有的 内酰胺类药物和内酰胺 内酰胺酶抑制剂均无临床疗效；绝大多 数的MRS常示多重耐药，包括氨基糖苷类、 大环内酯类、四环素类。,2019,-,53,（二）耐青霉素肺炎链球菌检测,1.定义 当对1 gml苯唑西林纸片抑菌 圈20mm或MIC006 gml互应视 为耐青霉素肺炎链球菌（PRSP）。 2.临床意义PRSP对氨苄西林、氨苄西林 舒巴坦、头孢克肟、头孢唑肟，临床治 疗的疗效很低。但应检测对头孢曲松、 头孢噻肟和美咯培南的MIC以判断是否对 这些抗生素敏感。,2019,-,54,（三）耐万古霉素肠球菌检测,2019,-,55,（四）超广谱内酰胺酶 肠杆菌科细菌检测,1定义 超广谱内酰胺酶是水解青霉素、 头孢菌素及单胺类的酶，主要由克雷伯菌 和大肠埃希菌、肠杆菌等细菌产生。,2019,-,56,当通过筛选法时对头孢泊肟、头孢他啶 （10ug 片）抑菌圈 22mm或氨曲南、 头孢噻肟（30 ug片） 27mm的菌 株经头孢他啶（30ug片）、头孢他啶 克拉维酸（3010ug）；头孢噻肟30ug、 头孢噻肟克拉维酸（3010ug）二组确 证试验。,2019,-,57,其结果为二组中任何一组药物，加克拉 维酸与不加克拉维酸的抑菌圈相比，增 大值35mm时即判定为产ESBL菌株。 2临床意义 产ESBL克雷伯菌和大肠埃希 菌不论其体外药物敏感试验结果如何， 对青霉素、头孢菌素和氨曲南治疗无 效。,2019,-,58,第五节 抗分枝杆菌药物敏感性试验,一、抗分枝杆菌药物 第一线药物为异烟、利福平、吡酸胺、 乙胺丁醇和链霉素； 第二线药物包括对氨基水杨酸、乙硫异 烟胺、环丝氨酸、卷曲霉素、卡那霉素、 丁胺卡那霉素和利福布丁。,2019,-,59,二、结核分枝杆菌和缓慢生长分枝杆菌体外抑菌试验,（一）结核分枝杆菌体外药敏试验指征 首次分离的分枝杆菌需做药敏试验，有助于合理用药和监测药物敏感性。另外经过三个月正规治疗，标本分离培养仍为阳性患者，或感染的严重疾患（如播散性结核病和结核性脑膜炎）以及来自高耐药流行区的患者，均须做体外药敏试验。,2019,-,60,（二）体外药敏试验方法,由于分枝杆菌生长缓慢，在分枝杆菌生长 前，药物已扩散至培养基中，不能有效影 响其生长。故常规用于需氧或兼性厌氧菌 的药敏试验方法不适用结核分枝杆菌。 有比例法、放射同位素法、绝对浓度法、 和耐药率法等四种方法。,2019,-,61,1培养基Middlebrook7H10琼脂添加油 酸、白蛋白、葡聚精触酶是慢生菌比 例法的推荐培养基； 2药敏试验药物 抗菌药物直接来自厂商， 不能用治疗的抗结核药物作为试验用 药。药物原液浓度至少为1000g/ml， 20贮存期6个月。,2019,-,62,3细菌接种,直接比例法药敏试验采用涂片阳性患者 标本；接种物是充分消化、无杂菌污染 的标本,接种菌液的稀释方法如下： 抗酸染色（1000 ）未见细菌，荧光染 色（450）25，菌液不稀释。抗酸染 色（1000）l10，荧光染色（450） 25250，菌液稀释或 101，102。,2019,-,63,观察含药琼脂格细菌生长情况用以4 表示：（：50100个菌落；2： 100200个菌落；3：200500个菌落； 4 ：500个以上菌落）。若测试菌生长 数大于对照格菌落数1，即判读为耐药菌。,2019,-,64,6质量控制,结核分枝杆菌 H37RV ATCC 27294为一线、 二线药的敏感质控菌株； H37RV ATCC35820为链霉素耐药质控菌株； H37RV ATCC35822为异烟耐药质控菌株； H37RV ATCC35826为环丝氨酸耐药质控菌株； H37RV ATCC35827为卡那霉素耐药质控菌株；,2019,-,65,三、快速生长分枝杆菌体外药敏试验,快速生长分枝杆菌是在合适的固体培养基 上孵育57天内能肉眼可见细菌菌落生长。 人类感染密切相关的有3种：偶发分枝杆菌、 龟分枝杆菌龟分枝亚种和脓肿亚种。 药物敏感试验操作方法基本同需氧和兼性 厌氧菌。,2019,-,66,第六节 厌氧菌体外抑菌试验,由于厌氧菌感染系内源性感染，厌氧 菌药物敏感性稳定，一般不做体外药 敏试验。 下述情况应考虑药敏试验：明确厌 氧菌引起的严重感染；已确证的厌 氧菌感染，经验性的选药治疗未能奏 效；需长期用药的厌