课件：细菌感染的病原学诊断、细菌分类与命名.ppt

细菌感染的病原学诊断,2019,-,1,第一节 临床标本的采集与处理,一、 标本采集的一般原则： （一）早期采集,三前,明显症状出现前,未使用抗菌药物之前,如已用抗生 素,应停 用12天,未出现合并或继发感染之前,2019,-,2,（二）无菌采集，避免污染 （三）不同病菌、不同疾病、采集不同标本 如: 伤寒 第一周 取血 第二、三周 取大、小便、骨髓 （四）根据检测项目的要求，应采集足量 （五）安全采集：避免标本污染；防止传播和自身感染 （六）标本应注明：姓名、年龄、性别、采集日期、临床诊断、检测项目,2019,-,3,二、标本处理原则 1、床旁接种 2、立即送检：一般在2小时内 3、保温（低温、嗜温）送检 4、保护送检：避免打翻、破流、污染、漏气。 5、安全送检：烈性传染病标本，专人送检。,2019,-,4,三、标本的检查方法 1、直接显微镜检测 2、病原体的分离培养和鉴定 3、病原体特异性抗原检测 4、血清学检测（特异性抗体检测） 5、病原体核酸检测,2019,-,5,第二节 细菌的形态学检查,细菌的形态学检查是细菌检验中最主要的基本方法之一。 工具必备的基本工具(显微镜)。 方法不染色标本检查和染色标本检查。,2019,-,6,（一）不染色标本检查法 主要用于观察生活状态下微生物某些形态特点及运动性 常用的方法有压滴法和悬滴法 如:用压滴法观察霍乱弧菌的“鱼群样运动” 悬滴法观察霍乱弧菌的“穿梭样运动” 如在同一方法制作的另一标本中加入效价1:64霍乱多价血清则穿梭样运动停止并发生凝集,则为制动试验(+),一、检查方法,2019,-,7,悬滴法制片的步骤,2019,-,8,暗视野检查 用于检查活菌、螺旋体及其动力 缺点是不能观察结构，不能鉴别染色性,2019,-,9,（二）染色标本检查法 1、常用的染料有 (1)碱性染料：显色离子带正电，易与带负电的病原体结合，如碱性复红、结晶紫、美兰。 (2)酸性染料：显色离子带负电，易与带正电的病原体结合，如伊红、刚果红。 (3)复合染料：又称中性染料，是酸、碱性染料的复合物，如伊红美兰、姬姆萨染料、荧光染料。,2019,-,10,2、染色标本的检查,染色,单染,复染,正染,负染 (negative staining),革兰染色法,抗酸染色法,荧光染色,2019,-,11,单染色:只用一种染料进行染色.,可分为: 正染:标本着色,背景不着色 负染:标本不着色,背景着色,用于形态的观察,不能鉴别染色性,如：白喉杆菌美兰染色,2019,-,12,复染色:用两种或两种以上的染料进行 染色,目前常用的有:革兰染色法、抗酸染 色法、荧光染色、特殊染色法,既可观察形态结构,又可鉴别染色性,2019,-,13,革兰染色法步骤:,制片: 涂片,染色:,结晶紫初染1分钟,水冲洗,碘液媒染1分钟,水冲洗,95%乙醇脱色30秒左右,水冲洗,稀释复红复染30秒,水冲洗,干后油镜下观察,干燥,固定,2019,-,14,2019,-,15,结果: 染成紫色称革兰染色阳性 G+ 染成红色称革兰染色阴性 G-,原理: (1)等电点学说 结晶紫为碱性染料,(2)化学学说 G+含有核糖核酸镁盐,能与结晶紫形成牢固的复合物,(3)通透性学说,2019,-,16,G+ G-,P I 23 46,核糖核酸镁盐 + -,通透性 小 大,脂质 少 多,2019,-,17,意义 : (1)鉴别细菌，有助于进一步鉴定。对有特殊形态结构及排列方式的病原菌可进行初步鉴定。 (2)指导临床用药 (3)了解细菌的致病性,2019,-,18,2019,-,19,特殊染色法:,1、鞭毛染色法: 2、荚膜染色法: 3、芽胞染色法:,2019,-,20,2019,-,21,2019,-,22,2019,-,23,第三节 细菌的分离培养 培养基： 概 念：是由人工配制的适合微生物生长繁殖使用的混合营养基质。 应有成分： 水份 碳源 氮源 能源 无机盐 生长因子,分为三大类,营养物质,凝固物质,抑制剂和指示剂,2019,-,24,培养基的组成成分: 1、营养物质：碳源、氮源、无机盐、生长因子等 （1）蛋白胨：是最常用的成分之一，提供细菌生长繁殖所需的氮源；含胨、多肽和多种氨基酸。其吸水性强，应密封干燥保存。 （2）肉汤：提供细菌生长繁殖所需的氮源和碳源及少量生长因子。,2019,-,25,（3）牛肉浸膏：由肉浸液经长时间加热浓缩而制成。糖类在加热过程中被破坏，所以其营养价值低于肉浸液，常用于制备培养基。 （4）糖类、醇类：为细菌生长提供碳源和能源。除葡萄糖、蔗糖主要作为碳源和能源的基本成分外，其他糖类和醇类主要用于鉴定细菌所做的发酵反应。,2019,-,26,（5）血液：血液中既含有蛋白质、多种氨基酸、糖类、无机盐类等营养物质，又能提供辅酶（如V因子）、血红素（X因子）等特殊生长因子。,2019,-,27,（6）无机盐类：提供细菌生长的各种元素，如：钾、钠、铁、硫等。用于制备培养基的无机盐类有多种，其中最常用的有氯化钠和磷酸盐，前者可维持酶的活性、调节菌体内外的渗透压，后者是细菌良好的碳源并具缓冲作用。,2019,-,28,（7）鸡蛋和动物血清:虽然不是构成培养基的基本成分,但却是某些细菌生长所必需的营养物质,所以仅用于制备一些特殊的培养基。 （8）生长因子：是细菌生长所必需的，但需要量很小。在制备培养基时，常加入维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等生长因子。,2019,-,29,2.凝固物质 制备固体培养基时，需在液体中加入凝固物质，最常用的凝固物质为琼脂，特殊情况下也可用明胶、卵白蛋白、血清等。 3.抑制剂和指示剂 它们并不是细菌生长繁殖所必需的物质，而是由于选择、鉴定及判断结果的需要。,2019,-,30,（1）抑制剂：在制备培养基时，加入一定种类的抑制剂，目的在于抑制非检出菌的生长，以利于检出菌的生长。常用的抑制剂有胆盐、煌绿、亚硫酸钠、亚硒酸钠及一些染料和某些抗生素。,2019,-,31,（2）指示剂：便于观察细菌是否利用和分解培养基中的糖、醇类。常用的有酚红、中性红、甲基红、溴甲酚紫、中国蓝等酸碱指示剂。美蓝常用作氧化还原指示剂。,2019,-,32,2019,-,33, 种 类：,按成分不同分为,天然培养基,合成培养基,半合成培养基,按用途分为,基础培养基,营养培养基,鉴别培养基,选择培养基,特殊培养基,2019,-,34,(二)培养基种类 1.基础培养基 含有细菌基础生长所需的基本营养成分，主要成分是肉汤和蛋白胨。广泛用于细菌和真菌的检验，也是制备其他培养基的基础成分。,2019,-,35,2.营养培养基 在基础培养基中加入葡萄糖、血液、生长因子等特殊成分，供营养要求较高的细菌和需要特殊生长因子的细菌生长繁殖。 如：血琼脂平板、巧克力色平板等,2019,-,36,2019,-,37,3.鉴别培养基 利用细菌分解糖类和蛋白质的能力及其代谢产物的不同，在培养基中加入特定的底物和指示剂，通过指示剂的反应不同来鉴别细菌。 如：单糖发酵管、伊红-美蓝琼脂培养基、克氏双糖铁琼脂等。,2019,-,38,4.选择培养基 在培养基中加入抑制剂，抑制标本中的杂菌生长，利于所需细菌的生长。 如： SS琼脂 麦康凯培养基,2019,-,39,5.特殊培养基 ：括厌氧培养基和细菌 L型培养基。,2019,-,40,庖肉基,2019,-,41,按物理性状分为,固体培养基,半固体培养基,液体培养基, 制作过程： 称量溶化调pH 过滤分装加塞包扎灭菌无菌检查,2019,-,42,细菌的分离培养和鉴定,1平板划线分离法 2斜面接种法 3液体接种法,（一）细菌的分离,4穿刺接种法 5倾注平板法 6涂布接种法,2019,-,43,2019,-,44,培养方法： 需氧培养法： 将已接种细菌的液体、半固体、固体培养基置37孵育1824h观察生长现象。,普 通 孵 箱,2019,-,45, 二氧化碳培养法,包括 1、二氧化碳孵箱 （能自动调节二氧化碳 的含量和温度）,二氧化碳培养箱,2019,-,46,2、烛缸法: 3、化学法： 按每升容积重碳酸钠0.4g与1mol/L盐酸0.35ml比例放入标本缸,密封后倾斜容器使两者接触产生CO2,烛缸二氧化碳培养法,2019,-,47,厌氧培养法：厌氧罐培育法和厌氧袋法 1、厌氧罐培育法：用理化方法除去密闭容器中的氧，造成无氧环境，以利于专性厌氧菌生长。 常用的有抽气换气法和气体发生袋法，以及需氧菌共生法、平皿焦性没食子酸法和庖肉基培养法,2019,-,48,例：抽气换气法：,将已接种的平板放入真空干燥缸或厌氧罐中，放入催化剂钯粒和指示剂美蓝，先用真空泵抽成负压99.99kPa，再充入无氧氮气，反复三次，最后充入80%N2、10%H2、10%CO2的混合气体，如罐内无氧，则指示剂美蓝变为无色美白。 每次观察标本应重新抽气换气,2019,-,49,厌 氧 罐,厌 氧 袋,厌氧盒,厌氧手套箱,2019,-,50,第四节 细菌代谢及代谢产物,（一）碳水化合物的代谢 1. 糖发酵试验（单糖发酵试验）,2019,-,51,糖,细菌,甲酸 + 溴甲酚紫,变黄,细菌,分解,甲酸,CO2和H2,结果表示: 不分解- 、产酸+、产酸产气 +,2019,-,52,甲基红试验（methy red，M）,葡萄糖,细菌,丙酮酸,产气杆菌,乙酰甲基甲醇,大肠杆菌,其他酸类,PH4.5+甲基红试剂,红色,主要用于大肠杆菌（+）和产气肠杆菌（）的鉴别,2019,-,53,2019,-,54,V-P（voges-proskauer）试验,两分子丙酮酸,脱羧缩合,乙酰甲基甲醇,KOH,二乙酰,胍基化合物,葡萄糖,红色化合物,细菌,常与甲基红试验一同使用，结果相反,2019,-,55,2019,-,56,葡萄糖氧化-发酵(O/F)试验,原理:细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型。 氧化型细菌在无氧环境中不能分解葡萄糖。 细菌在分解葡萄糖的过程中，可以进行无氧酵解的，称为发酵型。发酵型细菌无论在有氧或无氧的环境中都能分解葡萄糖。 不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。 利用此试验可以区分细菌的代谢类型。,2019,-,57,方法：将待检菌同时穿刺接种于两支Hugh-Leifson培养基，其中一支培养基滴加无菌的液体石蜡（或其他矿物油），高度不少于1cm。将培养基于35培养48h或更长。,2019,-,58,结果：两支培养基菌无变化为产碱型或不分解糖型；两支培养基均产酸为发酵型；若仅不加石蜡的培养基产酸为氧化型。 应用：主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别，前者均为发酵菌型，而后者通常为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌间的鉴别。,2019,-,59,2019,-,60,-半乳糖苷酶（ONPG）试验,某些细菌具有-半乳糖苷酶,分解,邻-硝基酚- -D半乳糖苷,黄色邻-硝基酚,迅速及迟缓发酵乳糖的细菌ONPG试验阳性 不发酵乳糖的细菌ONPG试验阴性,2019,-,61,七叶苷试验,原理：胆汁对某些细菌有抑制作用，只有既能在胆汁中生长，又能水解七叶苷的细菌才能表现出对七叶苷的水解活性。肠球菌和D群链球菌都能在含有胆盐的培养基中生长并水解七叶苷，生成七叶素，七叶素与培养基中枸橼酸铁的Fe2+反应形成黑色沉淀，使培养基变黑色。,2019,-,62,七叶苷（含胆盐的培养基）,肠球菌 D群链球菌,七叶素,+,枸橼酸铁,黑色沉淀,2019,-,63,方法：将被检菌接种胆汁-七叶苷琼脂培养基，35孵育1824h。 结果判断、解释和报告：细菌生长，且培养基变黑色为阳性，不变色为阴性。 此试验是鉴定肠球菌的重要试验，但不能区分D群中的肠球菌与非肠球菌。,2019,-,64,吲哚试验（indol，I）,色氨酸,具有色氨酸酶的细菌 分解,吲哚 (靛基质),对二甲基氨基苯甲醛 (吲哚试剂),红色玫瑰吲哚,主要用于肠杆菌科细菌的鉴别,（二）蛋白质和氨基酸的代谢,2019,-,65,2019,-,66,硫化氢试验,含硫氨基酸,细菌 分解,硫化氢无色气体,Fe2+/Pb2+,黑色硫化铅或硫化亚铁,主要用于肠杆菌科细菌中属及种的鉴别,2019,-,67,明胶液化试验,明胶,胞外酶,分解,氨基酸,失去凝固力,液态明胶,主要用于肠杆菌科细菌的鉴别 也用于鉴别炭疽杆菌（+）和类炭疽杆菌,2019,-,68,苯丙氨酸脱氨酶试验,苯丙氨酸,苯丙氨酸脱氨酶,脱氨基,苯丙酮酸,+,氯化铁,绿色,主要用于肠杆菌科细菌的鉴别,2019,-,69,氨基酸脱羧酶试验,氨基酸,氨基酸脱羧酶,脱羧,胺+CO2,溴甲酚紫,紫色,伤寒沙门菌（伤寒、鸡沙门菌除外） （+） 志贺菌属（宋内和鲍氏除外）（）,2019,-,70,尿素酶试验,尿素,含尿素酶的细菌,氨+酚红,红色,2019,-,71,枸橼酸盐利用试验 （citrate utilization，C）,枸橼酸盐,细菌分解,碳酸盐,铵盐,氨(培养基变为碱性),使溴麝香草酚蓝 由绿色变为深蓝,用于肠杆菌科中属间鉴别,（三）碳源和氮源利用实验,2019,-,72,IMViC试验:吲哚(I).甲基红(M).枸(C),结果:,大肠杆菌 + + - - (左图),产气杆菌 - - + + (右图),2019,-,73,第五节 细菌感染的血清学检测,一、凝集反应： 1、玻片凝集法： 原理：用已知抗体诊断血清在玻片上直接与细菌培养物或悬液混合，若有与抗体相应的细菌，则出现肉眼可见的颗粒或凝集块。 优点：该试验简单易行，特异性强，主要用于鉴定菌种及分型。,2019,-,74,2019,-,75,2、反向间接血凝试验,原理：将已知抗血清直接吸附或化学偶联的方法结合于红细胞表面，再与待测标本混合，若待测标本中有相应的细菌，则发生红细胞凝集。 优点：该试验敏感性高、反应快、结果易于观察常用于一些细菌及某些细菌毒素的测定。,2019,-,76,3、乳胶凝集试验,原理：将已知抗血清吸附于聚苯乙烯颗粒上，与相应抗原产生肉眼可见的乳胶颗粒凝集现象。用于细菌及一些激素的测定。 优点：因操作简单，反应快速而被临床广泛应用。,2019,-,77,4、协同凝集试验,原理：绝大多数金葡菌细胞壁的表面存在一种蛋白,葡萄球菌A蛋白（SPA）,他能与除IgG3外的IgG的Fc段发生非特异性结合后，Fab段仍可与特异性抗原结合。当金葡菌与已知的IgG连接时，则成为抗体致敏的颗粒载体，与相应细菌或抗原接触后，出现肉眼可见的凝集现象。,2019,-,78,含A蛋白 的金葡菌,IgG类抗体,结合IgG的 金葡菌,抗 原,凝集,协同凝集试验,2019,-,79,优点：该方法快速、简便、敏感性高，结果易于观察，广泛应用与细菌的快速鉴定和分型，有助于一些传染病的快速诊断,2019,-,80,二、新检测方法标记技术,新检测方法： 标 记 技 术,同位素标记放射免疫,荧光素标记免疫荧光技术,酶标记酶联免疫技术,免疫印迹法,2019,-,81,2019,-,82,2019,-,83,免疫印迹法 （Western blot. WB） 是凝胶电泳与固相免疫技术相结合的一种新型免疫生化技术。 技术包括三步： 十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电(SDS-PAGE) 分离样本蛋白质多肽。 转移电泳，将分离的多肽转移在固相介质上 免疫学检测，应用抗原抗体反应进行特异性分析 鉴定,2019,-,84,免疫印迹法示意图,2019,-,85,第六节 分子生物学检测,一、核酸杂交：来自两个不同个体的单链DNA相互结合成互补的DNA双链，此过程称为杂交。 利用DNA探针可直接检测病原菌及其产生的毒素,2019,-,86,一）、基本原理： 是一种在体外模拟天然DNA复制过程的核酸扩增技术，但反应体系较为简单。 包括变性-复性-延伸三步循环反应。 (1)变性：通过加热(95)使双链DNA解开成单链DNA。 (2)退火(引物粘合)：当温度突然降低时(55)，浓度很高的引物与其互补的模板在局部形成杂交链，以提供DNA聚合酶催化聚合所需的3-OH末端。,二、聚合酶链反应 PCR,2019,-,87,（3）聚合(引物延伸)：在Taq-DNA聚合酶、4种dNTP(脱氧核糖核苷酸)及Mg2+存在的条件下，聚合酶催化引物在3端不断延伸，在模板DNA链上形成新链，从而使模板DNA扩增1倍。 （4）在DNA聚合酶作用下，引物扩增延伸，每经过变性、复性、延伸一个循环，模板DNA增加一倍，而新合成的DNA又作为下一循环的模板，经过25-30个循环后原DNA量增加至106-109倍（拷贝）,2019,-,88,2019,-,89,2019,-,90,2019,-,91,二）引物的要求： 长度在15-30 bP G+C含量应在45-55%之间 碱基分布均匀，避免连续出现4个以上 自身无互补序列 两个引物之间同源碱基小于4个,2019,-,92,以上三步构成一个循环，每一循环的产物可作为下一次循环反应的模板，大约经25-30次循环反应，可使特异性DNA片段扩增100万倍(2小时)。 （1）两种引物：为保证DNA聚合酶能够对两条互补链均能进行延伸，需要两种引物，分别位于两条互补DNA链的3-端。 引物决定了PCR扩增产物的大小及其特异性，引物设计及合成的优劣直接涉及有效扩增能否成功，引物设计应考虑下述原则:,2019,-,93,引物长度：1530个碱基为宜，引物过短会使特异性降低，引物越长，扩增的特异性越好，但敏感性相应下降。 G+C含量：在40%-60%为宜，引物Tm值可用公式计算：Tm=4（G+C）+2（A+T） 碱基分布的随机性。应尽量避免具有多聚嘌呤或嘧啶核苷酸的序列，尤其3端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。,2019,-,94,引物自身：不应该存在互补序列，连续互补碱基不能多于3bp，否则引物自身会折叠形成发夹状二级结构。 两个引物之间不应该有多于4个的互补或同源碱基，尤其应避免3端的互补重叠，以防形成二聚体。 引物的3端：引物的3端是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。引物的3端最佳碱基选择是G和C，因为它们形成的碱基配对比较稳定。,2019,-,95,引物的5端：引物的5端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大，因此可以被修饰。引物的5端的修饰包括加酶切位点，标记生物素、荧光素、地高辛等，引入蛋白质结合DNA序列，引入突变位点等。 引物的特异性：引物与非特异性扩增序列的同源性不要超过90%或有8个互补碱基同源。,2019,-,96,(2)耐热Taq-DNA聚合酶（Taq酶）：这是在耐热细菌体内提取的一种DNA聚合酶，可保证在95 ，30分钟以上不会变性失活。0.5-5U/100L。 (3)四种脱氧核糖核苷酸：用作底物的dNTPs。20-200M。 (4)缓冲溶液：保证DNA聚合酶催化时所需的适当的溶液pH值。10-50mmol/L Tris-HCl(室温pH8.3-8.8, 72pH7.2)。 (5)Mg2+：是Taq-DNA聚合酶活性所必需。加入量比dNTPs浓度高0.5-2.5 mmol/L。,2019,-,97,三）.反应条件 (1)温度和时间 变性:95,30S；退火：45-55，30S-1min；延伸：72，1kb延伸1min,3-4kb需3-4min (2)循环次数 循环次数取决于模板DNA的浓度,理论上循环 225次后,PCR产物的累积即达最大值,但实际操作中,每步反应不可能达100%效率,一般按75%计算25-30次比较合理,循环次数太少,产物的量不多,循环次数过多,会导致PCR反应”平台效应”的出现。,2019,-,98,扩增产物分析 凝胶电泳分析法 斑点杂交分析法 酶谱分析法 根据酶切位置 序列分析法,2019,-,99,四）、PCR技术的特点 1.高度的敏感性 PCR产物的生成是以指数方式增加的，它可对单拷贝基因、单个细胞、单根头发、一滴血等微量标本进行分析。 2.高度的特异性 在PCR实验中，只要引物设计合理，反应温度适宜（5055），其扩增的特异性是很高的。其它因素如：酶浓度、dNTP、Mg2+、pH等对PCR的忠实性也有一定的影响。,2019,-,100,3.操作简便、迅速 已有多种类型的PCR扩增仪，只需把反应材料按一定的比例混合，置于仪器内，反应便会按所输入的程序进行。 4.适用样品广 PCR可特异扩增任何微量（pg、ng）的目的DNA或RNA片段，样品既可以是纯化的，又可以是粗制的；既可以是新鲜组织，也可以是陈旧样品；既可以是细胞，又可以是体液；既可以是完整的大分子DNA，也可以是部分降解的DNA。因此，PCR技术对扩增样品的要求不严格。,2019,-,101,五）、PCR技术在医学中的应用 由于PCR技术敏感、特异且操作简便，加上商品化PCR试剂盒的广泛应用，使得PCR 在临床疾病的诊断、法医学鉴定中具有极为重要的应用价值，并能为大多数实验室所接受。 1. PCR用于感染性疾病病原体的诊断和研究（病毒、细菌、寄生虫检测） 2遗传性疾病及肿瘤的诊断,2019,-,102,第七节 细菌毒素检测 内毒素的检测 1、鲎实验: 原理：鲎是一种海洋节肢动物，其血液和淋巴液有一种有核变形细胞，胞浆内有大量致密颗粒，内含凝固酶原及凝固蛋白原。当内毒素与鲎变形细胞冻融后的溶解物（鲎试剂）接触时，可激活凝固酶原，继而使可溶性的凝固蛋白原变成凝固蛋白而成凝胶状态，用以检测内毒素。 方法： 甲鲎试剂 乙鲎试剂 丙鲎试剂 标准内毒素 待检标本 无菌蒸馏水 结果:,2019,-,103,2、内毒素的致热作用: 原理：内毒素为外源性致热源可刺激白细胞产生内源性致热源，作用于体温调节中枢，引起机体发热。 方法 ：1）取家兔两只，分别测量基础体温 2）甲兔注射伤寒菌菌液，乙兔注射 等量生理盐水，每30分钟记录体 温变化 (家兔正常体温38.540) 结果：,2019,-,104,二、外毒素的检测,1、体内毒力试验 原理：细菌外毒素对机体的毒性作用可被相应的抗毒素中和，若先给动物注射抗毒素，再注射抗毒素，则动物不产生毒性症状。 方法：小鼠甲 小鼠乙 注射破伤风抗毒素 30min后肌注破伤风外毒素 直接肌注破伤风外毒素 结果:,2019,-,105,2、体外毒力试验：在体外用细菌外毒素的特异性免疫血清为抗体，与被检细菌外毒素（抗原）进行抗原-抗体反应，以检测细菌是否产生该种毒素。 如：检测白喉棒状杆菌的Elek平板试验,2019,-,106,第八节 动物试验,动物试验是临床细菌学检验的重要组成部分。具有以下实用价值： 1、分离鉴定病原体 2、测定细菌的毒力 LD50、ID50 3、制备免疫血清 4、建立致病动物模型，很多疾病的机制，首先采用动物模型进行研究所证实 5、动物血液、器官是配制培养基或制备实验材料 6、用于生物制品的安检、毒理、药理测试鉴定,2019,-,107,一、实验动物的分类 1、按遗传控制分类 (1)近交系动物（纯系动物） 指兄妹交配或亲子交配繁殖20代以上，纯系 动物具有以下优点： 具有长期遗传的稳定性 具有个体遗传的均一性 对实验的敏感性和结果的一致性 对实验结果的重复性好，可信度高。,2019,-,108,(2)突变系动物 指正常染色体中某个基因发生了变异，具有某种遗传缺陷的突变品系动物。无胸腺裸鼠,2019,-,109,(3)杂种动物： 是指无计划随意交配而繁殖的动物。 此类动物的特点是： 生命力旺盛 对各种生存环境、食物的适应能力强 繁殖率高、生长快（如野鼠） 易于饲养 缺点：遗传特征的稳定性差，对实验重复性差 结果可信度低。,2019,-,110,2、按微生物控制分类 (1)无菌动物 指在无菌条件下生长发育、无菌喂养，动物体内无菌，此类动物具有以下特点： 对病原体的感染受性相同 动物体内不含任何抗体 自身不患感染性疾病 对实验结果不产生任何干扰,2019,-,111,(2)悉生动物 是指无菌动物体内（肠道）人为的引入5-17种正常菌丛培育而成的动物，此种动物的繁殖力和抵抗力较无菌动物强。 (3)无特殊病原体的动物 是指严格设施标准喂养，严密监控和操作的，确无任何传染病的动物。 (4)清洁或最低限度疾病的动物。,2019,-,112,(5)转基因动物技术 自1978年发现限制性内切酶位点多态性，并用于镰刀形红细胞贫血的诊断技术以来。重组DNA技术的发展使基因突变的诊断技术向前迈了一大步。 随着基因工程与胚胎工程技术的不断发展，转基因技术也日趋成熟。,2019,-,113,用实验方法将外源基因导入到细胞或个体中去 方法：显微注射法 病毒载体法 精子载体法 电击或电泳冲 磷酸钙介导法 DEAE葡聚糖介导法 脂质体法 ES细胞法 原生质体融合法,2019,-,114,二、实验动物的选择 1、首先考虑对测试菌（病原体）敏感性高的动物。 2、根据实验目的、性质和要求的不同来选用动物。 3、数量要求达统计学处理标准。 4、尽可能考虑个体差异较小的动物。 5、经济、便于饲养、管理和实验操作方便,2019,-,115,三、动物的接种途径和方法 1、皮下注射 2、皮内注射 3、肌肉注射 4、腹腔注射 5、静脉注射 6、颅内注射,2019,-,116,2019,-,117,四、接种后的观察及解剖,观 察,行为活动,食欲状况,粪便特征,注射部位的变化,2019,-,118,解剖,解剖前的消毒处理,固定动物,剪开皮肤,打开胸、腹腔,取样,解剖后的处理,2019,-,119,五、动物采血 家兔：取静脉、心脏 绵羊：颈静脉 鸡：心脏 小鼠：尾部,2019,-,120,纸片法：原理 含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待测菌的的琼脂平板上，纸片所含药物吸取琼脂中的水分溶解和不断向纸片周围扩散，形成递减的浓度梯度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌环。抑菌环的大小与待测菌对药物的敏感程度成正比。,药敏实验,2019,-,121,五 、药敏试验：,可采用纸片法。,2019,-,122,2019,-,123,琼脂稀释法 稀释法： 肉汤稀释法试管、微量稀释法 1、琼脂稀释法：原理将不同剂量的抗菌药物加入融化并冷却至50的定量琼脂中，制成含不同递减浓度药物的平板。接种待测菌和35 孵育1824小时，无细菌生长的最低药物浓度为待测菌的最低抑菌浓度（M I C）。 本法是新药体外药敏实验验证时的金典参照标准,2019,-,124,2019,-,125,肉汤稀释法试管、微量稀释法 试管稀释法: 原理-用水解酪蛋白液体培养基将抗生素做不同浓度的稀释,然后种入待测细菌,定量测定抗菌药物对待测细菌的最低抑菌浓度(MIC)或最低杀菌浓度(MBC) 微量稀释法:目前已有用不同稀释浓度的抗菌药物经冷冻干燥后制成商品化试剂盒.检测时只需加入试验菌液,盖上盖板,透明胶布密封后351624h观察,凡孔底清晰或无细菌沉淀的即为该抗生素对试验的最低杀菌浓度(MIC),2019,-,126,2019,-,127,第九节 细菌的分类命名,一、分类原则:细菌的分类原则上分为传统分类和种系分类。,分类方法： （1