DNA片段的序列测定.ppt

实验四 DNA片段的序列测定,现代分子生物学大实验,了解Maxam-Gilbert 化学降解法基本原理 掌握Sanger双脱氧终止法的原理 学习测定重组质粒中外源DNA片段序列的基本原理和技术方法 学习使用毛细管序列测定仪进行DNA序列测定的方法,实验目的,实验原理,DNA电泳 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶 Maxam-Gilbert 化学降解法 Sanger 酶学法（双脱氧链终止法）,Maxam-Gilbert 化学降解法 1977年， A.M. Maxam 和 W. Gilbert 首先建立了 DNA 片段序列的测定方法。 将DNA 片段的 5端磷酸基作放射性标记，再分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基，从而产生一系列长度不一而 5 端被标记的 DNA 片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过凝胶电泳分离，再经放射线自显影，确定各片段末端碱基，从而得出目的 DNA 的碱基序列。,实验原理,Maxam-Gilbert 化学降解法测序原理,Maxam-Gilbert化学降解法测序的常用化学试剂,实验原理,多聚酶链式反应(polymerase chain reaction) 简称PCR技术 体外扩增特异DNA片段 操作简便，短时间, 数百万个特异的目的DNA序列的拷贝 PCR反应成分 模板DNA(template) 引物(primer) 脱氧核苷酸(dNTP) DNA聚合酶(Taq) PCR反应步骤 变性（denaturation） 退火（annealing） 延伸（extension ）,实验原理,变性（解链） 退火 延伸,DNA模板 引物 Taq酶 单核苷酸（dNTP),在高温（93-95）下，DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（3765）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72）下，以引物3端为合成的起点，以单核苷酸（dNTP)为原料，沿模板以53方向延伸，合成DNA新链。 每一双链的DNA模板，经过一次变性（解链）、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。 每一次循环所产生的DNA成为下一次循环的模板，PCR产物得以2n的指数形式迅速扩增，经过2530个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106107倍。,脱氧核糖核酸（dNTPs）,Sanger 双脱氧链终止法 引入了双脱氧核苷三磷酸（2,3-ddNTP）作为链终止剂 2,3-ddNTP与普通的dNTP不同之处在于前者的脱氧核糖的3位又少了个羟基。它可以在DNA聚合酶的作用下和多核苷酸链的3羟基形成磷酸二酯键，但却不能再与下一个核苷酸缩合，结果使得多核苷酸链的延伸终止。 在DNA的合成反应中，除了加入4种正常的dNTP外，再加入一种少量的ddNTP，反应产物是一系列的长短不一的核苷酸链。在4组独立的DNA合成反应中，分别加入4种不同的ddNTP，结果将生成4组核苷酸链，它们将分别终止于每一个A，每一个G，每一个C，每一个T的位置上。对这4组核苷酸链进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列。,实验原理,Dr Fred Sanger, double Nobel laureate and developer of the dideoxy sequencing method, first published in December 1977,化学，1958年：测定胰岛素分子的结构 化学，1980年：核酸DNA序列的确定方法,DNA测序,毛细管自动测序仪,测序仪的重大改进 荧光染料代替了放射性核素 聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作自动化 应用计算机软件对测序结果进行收集和分析，测序之后可以直接从机器上读出目的片段的序列。 从每次一个样品（单毛细管）到96个或384个样品（多组毛细管） 精确、规模、快速,毛细管自动测序仪,同手工测序一样，DNA聚合酶延伸反应结束后，样品经简单变性处理就可以在测序凝胶中开始电泳。 荧光自动测序系统是以种荧光素分别标记种ddNTP，PCR延伸反应后产生的是4组由不同双脱氧核苷酸终止的DNA片段，这四种荧光染料在激光激发下发出不同波长的荧光，因而每一种荧光代表一种碱基，这使得它们都具有“特征的颜色”。 当不同荧光标记的DNA片段电泳经过检测窗口时，被激光激发出不同波长的光线，CCD相机记录结果，可对多个样品同时检测。,MegaBACE 毛细管自动测序仪,实验设备,PCR仪 Megabase毛细管自动测序仪 离心机,Dye Terminator Cycle Sequencing（荧光染料标记末端循环测序） 四种双脱氧末端都分别用染料标记作为供体染料的荧光素和作为受体染料的四种不同的荧光染料。,实验设备,测序仪,光源：波长488nm的氩离子激光,双脱氧末端,荧光素 + 四种不同的荧光染料 （供体染料） (受体染料),实验试剂,测序反应试剂（DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit） 酶、dNTP、ddNTP混合物 Loading buffer（70% formamide,1 mM EDTA) 测序反应缓冲液 测序胶 无菌水 测序引物：根据T-载体上的引物序列合成 7.5 mol/L NH4AC 无水乙醇 75%乙醇,实验步骤,测序PCR反应 反应体系 H2O up till 10.0 L 10buffer 0.9 L DNA 200ng-1g primer(5M ) 1.0L 酶、dNTP 、ddNTP混合物 0.4 L 反应条件 95 20sec 50 20sec 60 1min30sec 30个循环,测序PCR反应后处理（纯化、浓缩、缓冲液置换） PCR产物中加入1L的4 mol/L NH4AC ，混匀，加入27.5L的无水乙醇，混匀，室温放置min。 12000rpm，4，离心15 min 。 弃上清，70%乙醇洗一次，12000rpm，4，离心5 min 。 弃上清，室温干燥30 min 。 加入10L Loading buffer，充分混匀，即可进行序列测定。,实验步骤,实验步骤,按照操作手册，利用毛细管自动测序仪进行序列的测定 开氮气罐，打开测序仪，打开电脑。 设定参数。 冲洗毛细管。 灌胶，预电泳。 上样，电泳。 电泳后处理分析数据。 冲洗毛细管，关机。,注意事项,准确估计PCR反应过程中质粒模板的浓度，浓度过低，测序信号弱，得不到好的测序结果；浓度过高，引物峰出现晚，影响测定的序列长度。 PCR反应后的处理过程应小心，不要丢弃沉淀。 NH4AC的加入是助沉作用，与PCR反应产物混匀后再加入室温的无水乙醇，室温放置片刻等PCR反应产物完全沉淀后再离心。 使用测序