5氟尿嘧啶对肺腺癌A549细胞生长抑制作用机制的研究.doc

5氟尿嘧啶对肺腺癌A549细胞生长抑制作用机制的研究作者：张德海张晴张翠云高振月【摘要】目的研究5氟尿嘧啶抑制人肺腺癌细胞生长的作用方式。方法用不同浓度的5氟尿嘧啶处理体外培养的人肺癌A549细胞，应用MTT法、倒置相差显微镜和吖啶橙染色法分析检测A549细胞存活率的变化及细胞形态结构的变化。结果不同浓度的5氟尿嘧啶处理A549细胞，随着药物浓度的增加和处理时间的延长，细胞存活率明显下降；且低浓度使细胞呈铺展状态，细胞质内空泡增多，吖啶橙染色显示酸性膜泡增多，高浓度使细胞变圆，出现凋亡状态。结论5氟尿嘧啶能明显抑制A549细胞的生长，低浓度诱导细胞发生自噬，高浓度引起细胞凋亡。【关键词】5氟尿嘧啶；肺癌；自噬；凋亡【Abstract】ObjectiveTostudytheinhibitiveeffectof5fluorouracilonthegrowthofhumanlungcarcinomacellsA549.MethodsWithdifferentconcentrationsof5fluorouracilinvitroprocessingofhumanlungcancerA549cells,MTTassay,invertedmicroscopeandacridineorangestainingwereusedtodeterminecellviabilityandmorphologicalchanges.ResultsUsingdifferentconcentrationsof5fluorouraciltodealwithA549cells,withtheincreaseindrugconcentrationandtreatmenttime,cellsurvivalratedecreasedsignificantly；andlowconcentrationof5fluorouracilinducedthecellspreadandincreasedvacuolizationwithinthecytoplasm,acridineorangestainingshowedanincreaseinacidicvesicles,highconcentrationmadethecellroundandcellapoptosis.Conclusion5fluorouracilinhibitedthegrowthofA549cellssignificantly,withautophagybylowconcentrationsandapoptosisbyhighconcentrations.【Keywords】5fluorouracil，lungcancer，autophagy，apoptosis5氟尿嘧啶(5fluorouracil,5Fu)是临床上常见的抗肿瘤化疗药物，它可以抑制肿瘤细胞生长1,常用于治疗结直肠癌、消化道癌、乳腺癌、绒毛膜上皮癌等多种恶性肿瘤。5Fu是一种嘧啶类似物,可在细胞内转化成不同的细胞毒性代谢产物，与DNA和RNA结合，从而干扰DNA和RNA的合成，从而起到抑制肿瘤细胞生长的作用，但其抑制肿瘤细胞生长的作用机制尚不清楚。近年来，国内外许多研究表明，5氟尿嘧啶抑制肿瘤细胞生长是通过诱导细实现的2，3；而也有研究证明，5氟尿嘧啶能诱导细胞发生自噬4。本研究以人肺腺癌A549细胞为例，来探讨5氟尿嘧啶抑制人肺腺癌A549细胞生长的作用机制，以期为临床治疗提供理论依据。1材料与方法1.1材料人肺腺癌A549细胞，HAMS/F12细胞培养液(美国GIBCOBRL公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，胰酶(上海生工)，二甲基亚砜(Sigma公司)。5氟尿嘧啶(深圳万乐药业有限公司)用二甲基亚砜(DMSO)溶解。1.2细胞培养A549肺癌细胞系在含10%胎牛血清的HAMS/F12培养基中，置于37，5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。每3d半量换液传代，实验中选用对数生长期细胞。5Fu用DMSO溶解成1mol/L储存液-20保存，使用前用细胞培养液稀释成所需浓度。1.3实验分组根据加入的5氟尿嘧啶浓度不同将细胞分组：对照组；加药组(分别为5、10、20、40、80、100、200、300、400M)。将各组细胞接种到24孔和96孔板中，每孔细胞浓度为2104/ml，置于37、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养24h后加药，分别于加药后24、48h进行观察和分析。1.4细胞形态学观察各组细胞加药24、48h后，倒置相差显微镜下观察24、48h细胞形态变化。1.5MTT法检测细胞琥珀酸脱氢酶的活性将上述培养于96孔板中的细胞根据实验分组加入不同浓度的5氟尿嘧啶，于各组药物处理终止前4h每孔加入5mg/mlMTT液20l，继续培养4h，然后小心吸出各孔内培养液，加入100lDMSO，振荡至结晶全部溶解，酶标仪上570nm测定光密度(OD值)。取各平行孔OD值的平均值,根据下式计算细胞相对存活率:存活细胞%=(实验组OD值/对照组OD值)100%(以不含细胞的培养液为空白组调零)。1.6吖啶橙染色观察细胞质内酸性膜泡变化上述培养于24孔板中的细胞用不同浓度的5氟尿嘧啶处理48h后，将旧培养液吸出，PBS洗两遍，加入两滴0.1mg/ml吖啶橙染液染色1min，PBS洗两遍，于倒置荧光显微镜下观察结果。1.7统计学处理实验数据以xs表示,经重复测量资料的方差分析,P<；0.05表示有统计学意义。2结果2.15氟尿嘧啶对A549细胞存活率的影响用MTT法检测了5氟尿嘧啶对A549细胞增殖的影响(表1)。用5、10、20、40、80、100、200、300、400M的5氟尿嘧啶，分别处理A549细胞24、48h。数据显示，5氟尿嘧啶对A549细胞的影响表现出一定的浓度和时间依赖性关系。随药物处理时间的延长，细胞存活率降低；随药物浓度的增加，细胞存活率也表现出降低趋势。表15Fu对A549细胞存活率的影注：单因素方差分析P<；0.01，进一步两两比较(同一时间段不同加药浓度组与对照组相比)P均小于0.012.25氟尿嘧啶对A549细胞形态学影响：A549细胞经不同浓度的5氟尿嘧啶处理48h后，在倒置显微镜下观察细胞形态变化(图1)，发现10100M处理组细胞质出现明显的空泡化，且10、20M组空泡化现象尤其明显；300M处理组细胞出现明显的细胞凋亡特征；400M处理组除有凋亡外还出现了明显的细胞坏死现象。2.3吖啶橙染色观察细胞质变化为了进一步明确5氟尿嘧啶处理A549细胞后引起的细胞质的变化，我们用吖啶橙染色来观察细胞质内酸性膜泡的变化。不同浓度的5氟尿嘧啶处理A549细胞48h后，吖啶橙染色结果发现(图2)，与对照组相比5氟尿嘧啶处理组细胞质内酸性膜泡均明显增多，且10、20M处理组尤为明显，这与形态观察结果一致。3讨论目前，多数学者将细胞的死亡形式分为凋亡(apoptosis)、自噬性细胞死亡(autophagy)和坏死(necrosis)三种类型5，6，其中凋亡和自噬性细胞死亡属于程序性细胞死亡(programmedcelldeath)，分别被称为型程序性细胞死亡和型程序性细胞死亡。多年来，人们对型程序性细胞死亡细胞凋亡的形态学、参与分子及其调控机制的研究颇多，对其在抑制肿瘤细胞生长中的作用较为了解，而对型程序性细胞死亡细胞自噬，了解较少。自噬是细胞内的物质成分被溶酶体降解的统称，它是真核细胞所特有的，负责长寿命蛋白和一些细胞器的降解再利用7，在生物体的发育、正常生理活动和许多疾病中发挥重要作用。近年来许多研究表明，自噬与肿瘤的关系非常密切，像凋亡一样，自噬在调节癌症的发生，发展和决定肿瘤细胞对抗癌治疗的反应等方面起着很重要的作用，然而，对这一作用，研究者们颇有争议，至今尚无定论。本实验细胞存活率检测结果表明(表1)，用不同浓度的5氟尿嘧啶处理A549细胞24、48h，细胞存活率均呈现浓度和时间的依赖性关系，说明5氟尿嘧啶具有抑制肺腺癌细胞生长的作用。形态学观察结果显示(图1)，随5氟尿嘧啶浓度的增高，细胞表现出不同的反应：低浓度(<；200M)时，细胞呈铺展状态，细胞质内空泡增多；高浓度(300M)时，细胞变圆，出现凋亡现象。这一结果提示，5氟尿嘧啶抑制肺腺癌A549细胞生长的作用方式可能是低浓度时诱导细胞发生自噬、高浓度时引起细胞凋亡。细胞自噬可能是在应激条件下被激活，起到延缓细胞凋亡的作用。为了进一步证实5氟尿嘧啶低浓度时是否诱导了细胞自噬的发生，我们采用吖啶橙染色方法来观察自噬泡(autophagicvacuoles)是否存在。吖啶橙染色结果显示(图2)，不同浓度的5氟尿嘧啶处理细胞后，细胞质内的酸性膜泡增多，而且5氟尿嘧啶10、20M处理组细胞内酸性膜泡最多，随药物浓度的增高，细胞内酸性膜泡逐渐减少。近年来，用吖啶橙染色法来观察应激条件下细胞质内酸性膜泡的变化，已经成为一种常用的鉴别细胞自噬的方法8。因此，我们的实验结果表明，5氟尿嘧啶低浓度处理A549细胞时，诱导了细胞自噬的发生。以往许多研究表明，5氟尿嘧啶抗肿瘤的机制是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现的，而如今临床治疗发现，5氟尿嘧啶的耐药性在治疗过程中已变得非常普遍，成为治疗失败的重要原因。最新有研究证明，5氟尿嘧啶能够诱导结肠癌细胞发生自噬9，提示自噬在5Fu治疗肿瘤的过程中有不可忽视的作用。我们上述研究也发现，低浓度的5氟尿嘧啶能诱导人肺腺癌A549细胞发生自噬，高浓度的5氟尿嘧啶能引起A549细胞凋亡甚至坏死。因此，探索肿瘤细胞自噬的机制，阻断自噬的发生，降低肿瘤耐药性，可能是降低药物毒性提高肿瘤治疗效率的新策略。(致谢：感谢滨州医学院李尊岭老师馈赠人肺腺癌A549细胞。)【参考文献】1YamaguchiF,KamitoriK,SanadaK,etal.Raresugardalloseenhancesantitumoreffectof5fluorouracilonthehumanhepatocellularcarcinomacelllineHuH7J.JBiosciBioeng，2008，106(3):248252.2ChenCY,JiaJH,ZhangMX,etal.Comparativeproteomicsofapoptosisinitiationinducedby5fluorouracilinhumangastriccancerJ.ChinJPhysiol，2006,49(1):3138.3QinL,ZhangX,ZhangL,etal.DownregulationofBMI1enhances5fluorouracilinducedapoptosisinnasopharyngealcarcinomacellsJ.BiochemBiophysResCommun，2008，371(3):531535.4VonBltzingslwenI,JontellM,HurstP,etal.5FluorouracilinducesautophagicdegenerationinratoralkeratinocytesJ.OralOncol，2001,37(6):537544.5EdingerAL,ThompsonCB.Deathbydesign:apoptosis,necrosisandautophagyJ.CurrOpinCellBiol，2004,16(6):663669.6SingletaryK,MilnerJ.Diet,autophagy,andcancer:areviewJ.CancerEpidemiolBiomarkersPrev，2008，17(7):15961610.7FarreJC,SubramaniS.Peroxisometurnoverbymicropexophagy:anautophagyrelatedprocessJ.TrendsCellBiol,2004,14(9):515523.8LiuK,TangQ,FuC,etal.