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5氟尿嘧啶对肺腺癌A549细胞生长抑制作用机制的研究.doc5氟尿嘧啶对肺腺癌A549细胞生长抑制作用机制的研究.doc -- 5 元

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5氟尿嘧啶对肺腺癌A549细胞生长抑制作用机制的研究作者张德海张晴张翠云高振月【摘要】目的研究5氟尿嘧啶抑制人肺腺癌细胞生长的作用方式。方法用不同浓度的5氟尿嘧啶处理体外培养的人肺癌A549细胞,应用MTT法、倒置相差显微镜和吖啶橙染色法分析检测A549细胞存活率的变化及细胞形态结构的变化。结果不同浓度的5氟尿嘧啶处理A549细胞,随着药物浓度的增加和处理时间的延长,细胞存活率明显下降且低浓度使细胞呈铺展状态,细胞质内空泡增多,吖啶橙染色显示酸性膜泡增多,高浓度使细胞变圆,出现凋亡状态。结论5氟尿嘧啶能明显抑制A549细胞的生长,低浓度诱导细胞发生自噬,高浓度引起细胞凋亡。【关键词】5氟尿嘧啶肺癌自噬凋亡【Abstract】ObjectiveTostudytheinhibitiveeffectof5fluorouracilonthegrowthofhumanlungcarcinomacellsA549.MethodsWithdifferentconcentrationsof5fluorouracilinvitroprocessingofhumanlungcancerA549cells,MTTassay,invertedmicroscopeandacridineorangestainingwereusedtodeterminecellviabilityandmorphologicalchanges.ResultsUsingdifferentconcentrationsof5fluorouraciltodealwithA549cells,withtheincreaseindrugconcentrationandtreatmenttime,cellsurvivalratedecreasedsignificantlyandlowconcentrationof5fluorouracilinducedthecellspreadandincreasedvacuolizationwithinthecytoplasm,acridineorangestainingshowedanincreaseinacidicvesicles,highconcentrationmadethecellroundandcellapoptosis.Conclusion5fluorouracilinhibitedthegrowthofA549cellssignificantly,withautophagybylowconcentrationsandapoptosisbyhighconcentrations.【Keywords】5fluorouracil,lungcancer,autophagy,apoptosis5氟尿嘧啶5fluorouracil,5Fu是临床上常见的抗肿瘤化疗药物,它可以抑制肿瘤细胞生长1,常用于治疗结直肠癌、消化道癌、乳腺癌、绒毛膜上皮癌等多种恶性肿瘤。5Fu是一种嘧啶类似物,可在细胞内转化成不同的细胞毒性代谢产物,与DNA和RNA结合,从而干扰DNA和RNA的合成,从而起到抑制肿瘤细胞生长的作用,但其抑制肿瘤细胞生长的作用机制尚不清楚。近年来,国内外许多研究表明,5氟尿嘧啶抑制肿瘤细胞生长是通过诱导细实现的2,3而也有研究证明,5氟尿嘧啶能诱导细胞发生自噬4。本研究以人肺腺癌A549细胞为例,来探讨5氟尿嘧啶抑制人肺腺癌A549细胞生长的作用机制,以期为临床治疗提供理论依据。1材料与方法1.1材料人肺腺癌A549细胞,HAM′S/F12细胞培养液美国GIBCOBRL公司,胎牛血清杭州四季青生物工程材料有限公司,胰酶上海生工,二甲基亚砜Sigma公司。5氟尿嘧啶深圳万乐药业有限公司用二甲基亚砜DMSO溶解。1.2细胞培养A549肺癌细胞系在含10胎牛血清的HAM′S/F12培养基中,置于37℃,5CO2饱和湿度的培养箱中培养。每3d半量换液传代,实验中选用对数生长期细胞。5Fu用DMSO溶解成1mol/L储存液20℃保存,使用前用细胞培养液稀释成所需浓度。1.3实验分组根据加入的5氟尿嘧啶浓度不同将细胞分组①对照组②加药组分别为5、10、20、40、80、100、200、300、400μM。将各组细胞接种到24孔和96孔板中,每孔细胞浓度为2104/ml,置于37℃、5CO2饱和湿度的培养箱中培养24h后加药,分别于加药后24、48h进行观察和分析。1.4细胞形态学观察各组细胞加药24、48h后,倒置相差显微镜下观察24、48h细胞形态变化。1.5MTT法检测细胞琥珀酸脱氢酶的活性将上述培养于96孔板中的细胞根据实验分组加入不同浓度的5氟尿嘧啶,于各组药物处理终止前4h每孔加入5mg/mlMTT液20μl,继续培养4h,然后小心吸出各孔内培养液,加入100μlDMSO,振荡至结晶全部溶解,酶标仪上570nm测定光密度OD值。取各平行孔OD值的平均值,根据下式计算细胞相对存活率存活细胞实验组OD值/对照组OD值100以不含细胞的培养液为空白组调零。1.6吖啶橙染色观察细胞质内酸性膜泡变化上述培养于24孔板中的细胞用不同浓度的5氟尿嘧啶处理48h后,将旧培养液吸出,PBS洗两遍,加入两滴0.1mg/ml吖啶橙染液染色1min,PBS洗两遍,于倒置荧光显微镜下观察结果。1.7统计学处理实验数据以x±s表示,经重复测量资料的方差分析,Plt0.05表示有统计学意义。2结果2.15氟尿嘧啶对A549细胞存活率的影响用MTT法检测了5氟尿嘧啶对A549细胞增殖的影响表1。用5、10、20、40、80、100、200、300、400μM的5氟尿嘧啶,分别处理A549细胞24、48h。数据显示,5氟尿嘧啶对A549细胞的影响表现出一定的浓度和时间依赖性关系。随药物处理时间的延长,细胞存活率降低随药物浓度的增加,细胞存活率也表现出降低趋势。表15Fu对A549细胞存活率的影注单因素方差分析Plt0.01,进一步两两比较同一时间段不同加药浓度组与对照组相比P均小于0.012.25氟尿嘧啶对A549细胞形态学影响A549细胞经不同浓度的5氟尿嘧啶处理48h后,在倒置显微镜下观察细胞形态变化图1,发现10~100μM处理组细胞质出现明显的空泡化,且10、20μM组空泡化现象尤其明显300μM处理组细胞出现明显的细胞凋亡特征400μM处理组除有凋亡外还出现了明显的细胞坏死现象。2.3吖啶橙染色观察细胞质变化为了进一步明确5氟尿嘧啶处理A549细胞后引起的细胞质的变化,我们用吖啶橙染色来观察细胞质内酸性膜泡的变化。不同浓度的5氟尿嘧啶处理A549细胞48h后,吖啶橙染色结果发现图2,与对照组相比5氟尿嘧啶处理组细胞质内酸性膜泡均明显增多,且10、20μM处理组尤为明显,这与形态观察结果一致。3讨论目前,多数学者将细胞的死亡形式分为凋亡apoptosis、自噬性细胞死亡autophagy和坏死necrosis三种类型5,6,其中凋亡和自噬性细胞死亡属于程序性细胞死亡programmedcelldeath,分别被称为Ⅰ型程序性细胞死亡和Ⅱ型程序性细胞死亡。多年来,人们对Ⅰ型程序性细胞死亡细胞凋亡的形态学、参与分子及其调控机制的研究颇多,对其在抑制肿瘤细胞生长中的作用较为了解,而对Ⅱ型程序性细胞死亡细胞自噬,了解较少。自噬是细胞内的物质成分被溶酶体降解的统称,它是真核细胞所特有的,负责长寿命蛋白和一些细胞器的降解再利用7,在生物体的发育、正常生理活动和许多疾病中发挥重要作用。近年来许多研究表明,自噬与肿瘤的关系非常密切,像凋亡一样,自噬在调节癌症的发生,发展和决定肿瘤细胞对抗癌治疗的反应等方面起着很重要的作用,然而,对这一作用,研究者们颇有争议,至今尚无定论。本实验细胞存活率检测结果表明表1,用不同浓度的5氟尿嘧啶处理A549细胞24、48h,细胞存活率均呈现浓度和时间的依赖性关系,说明5氟尿嘧啶具有抑制肺腺癌细胞生长的作用。形态学观察结果显示图1,随5氟尿嘧啶浓度的增高,细胞表现出不同的反应低浓度lt200μM时,细胞呈铺展状态,细胞质内空泡增多高浓度≥300μM时,细胞变圆,出现凋亡现象。这一结果提示,5氟尿嘧啶抑制肺腺癌A549细胞生长的作用方式可能是低浓度时诱导细胞发生自噬、高浓度时引起细胞凋亡。细胞自噬可能是在应激条件下被激活,起到延缓细胞凋亡的作用。为了进一步证实5氟尿嘧啶低浓度时是否诱导了细胞自噬的发生,我们采用吖啶橙染色方法来观察自噬泡autophagicvacuoles是否存在。吖啶橙染色结果显示图2,不同浓度的5氟尿嘧啶处理细胞后,细胞质内的酸性膜泡增多,而且5氟尿嘧啶10、20μM处理组细胞内酸性膜泡最多,随药物浓度的增高,细胞内酸性膜泡逐渐减少。近年来,用吖啶橙染色法来观察应激条件下细胞质内酸性膜泡的变化,已经成为一种常用的鉴别细胞自噬的方法8。因此,我们的实验结果表明,5氟尿嘧啶低浓度处理A549细胞时,诱导了细胞自噬的发生。以往许多研究表明,5氟尿嘧啶抗肿瘤的机制是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现的,而如今临床治疗发现,5氟尿嘧啶的耐药性在治疗过程中已变得非常普遍,成为治疗失败的重要原因。最新有研究证明,5氟尿嘧啶能够诱导结肠癌细胞发生自噬9,提示自噬在5Fu治疗肿瘤的过程中有不可忽视的作用。我们上述研究也发现,低浓度的5氟尿嘧啶能诱导人肺腺癌A549细胞发生自噬,高浓度的5氟尿嘧啶能引起A549细胞凋亡甚至坏死。因此,探索肿瘤细胞自噬的机制,阻断自噬的发生,降低肿瘤耐药性,可能是降低药物毒性提高肿瘤治疗效率的新策略。致谢感谢滨州医学院李尊岭老师馈赠人肺腺癌A549细胞。【参考文献】1YamaguchiF,KamitoriK,SanadaK,etal.Raresugardalloseenhancesantitumoreffectof5fluorouracilonthehumanhepatocellularcarcinomacelllineHuH7J.JBiosciBioeng,2008,1063248252.2ChenCY,JiaJH,ZhangMX,etal.Comparativeproteomicsofapoptosisinitiationinducedby5fluorouracilinhumangastriccancerJ.ChinJPhysiol,2006,4913138.3QinL,ZhangX,ZhangL,etal.DownregulationofBMI1enhances5fluorouracilinducedapoptosisinnasopharyngealcarcinomacellsJ.BiochemBiophysResCommun,2008,3713531535.4VonBültzingslwenI,JontellM,HurstP,etal.5FluorouracilinducesautophagicdegenerationinratoralkeratinocytesJ.OralOncol,2001,376537544.5EdingerAL,ThompsonCB.Deathbydesignapoptosis,necrosisandautophagyJ.CurrOpinCellBiol,2004,166663669.6SingletaryK,MilnerJ.Diet,autophagy,andcancerareviewJ.CancerEpidemiolBiomarkersPrev,2008,17715961610.7FarreJC,SubramaniS.PeroxisometurnoverbymicropexophagyanautophagyrelatedprocessJ.TrendsCellBiol,2004,149515523.8LiuK,TangQ,FuC,etal.InfluenceofglucosestarvationonthepathwayofdeathininsectcelllineSlapoptosisfollowsautophagyJ.Cytotechnology,2007,54297105.9LiJ,HouN,FariedA,etal.Inhibitionofautophagyby3MAenhancestheeffectof5FUinducedapoptosisincoloncancercellsJ.AnnSurgOncol,2009,163761771.
编号:201312182200523865    大小:32.50KB    格式:DOC    上传时间:2013-12-18
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abingge上传于2013-12-18

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